miRNA-141在肝癌組織中的表達(dá)及其在細(xì)胞增殖中的作用與機(jī)制研究

張偉，王偉民，梁驍，于鳴，張帆

1西安市第四醫(yī)院普外科，西安710004

2中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院普外科，西安0650000

肝癌是中國乃至世界常見的惡性腫瘤，尤其在男性中較為常見。中國屬于肝癌高發(fā)國家，據(jù)不完全統(tǒng)計，中國每年肝癌的病死率位居世界癌癥死亡原因的第3位和中國的第2位，近年來，肝癌的發(fā)病率和病死率均呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢[1]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與醫(yī)療水平的發(fā)展，新型的治療手段不斷出現(xiàn)，但是肝癌的總體治療效果并未得到明顯改善[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其長度為20～25個核苷酸。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表達(dá)與多種惡性腫瘤有關(guān)，它可以直接或間接地激活或抑制原癌基因/抑癌基因的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。因此，挖掘肝癌細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物，尋找新的治療靶點(diǎn)，深化對肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究，是目前肝癌研究的主要內(nèi)容[5]。miRNA-141是miRNA-200家族的成員之一，長度為22個堿基，位于12p13.31染色體。與正常組織相比，miRNA在不同類型的腫瘤組織中表達(dá)不同，在部分腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[6-9]，而在另一些腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)[10-15]。因此，推測miRNA-141的表達(dá)情況可能取決于腫瘤來源和腫瘤分期及其發(fā)展情況。miRNA-141在肝癌中的表達(dá)下調(diào)，但miRNA-141在肝癌中的作用機(jī)制及臨床價值尚不明確。因此，本研究就miRNA-141在肝癌組織中的表達(dá)及其在細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探索，旨在為肝癌的臨床治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2、肝細(xì)胞癌癌旁正常組織保存于西安市第四醫(yī)院實驗室。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）、膠原酶Ⅰ均購自美國Gibco公司，蛋白裂解液RⅠPA購自南京諾唯贊生物科技有限公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、甘氨酸、Tris、TEMED、30%Acr-Bis、脫脂奶粉均購自北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司，一抗購自Abcam公司，二抗和青霉素-鏈霉素雙抗均購自美國Sigma公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自以色列BⅠ公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Abcam公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）檢測分析試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich公司，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀購自美國Bio-Rad公司，普通PCR儀購自美國Biometra公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司，電泳儀、水平電泳槽均購自北京六一儀器廠，高速冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)廠，光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，置于37℃、50%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。加入0.25%的胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代。傳代時，將細(xì)胞懸液均勻地分配至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基補(bǔ)充至每瓶6 ml，繼續(xù)培養(yǎng)，以用于后續(xù)實驗。

1.2.2 過表達(dá)miRNA-141的細(xì)胞系建立 取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2×105個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗組轉(zhuǎn)染 pCDNA3.1-miRNA-141（NR_002578.2,651 bp），陰性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空載體，轉(zhuǎn)染后6～8 h換液，以未處理的細(xì)胞作為空白對照，48 h后更換含有2 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，將細(xì)胞傳至新的6孔板中，1～2周后，待細(xì)胞出現(xiàn)克隆，挑取單克隆至96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，鋪滿后，將每孔的單克隆傳至6孔板中，2天后將細(xì)胞傳至培養(yǎng)瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定細(xì)胞系，命名為miRNA-141過表達(dá)組、陰性轉(zhuǎn)染組、對照組。

1.2.3 RNA的抽提及質(zhì)量檢測 ①倒掉培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞3次，以每孔1 ml的量加入Trizol裂解液于冰上裂解5 min，反復(fù)吹打細(xì)胞幾次，將其移至1.5 ml無菌無酶的離心管中；②冰浴10 min；③于每個離心管中加入0.2 ml預(yù)冷的三氯甲烷，立即劇烈振蕩15 s后，冰浴5 min；④4℃離心機(jī)離心20 min，13 000 r/min；⑤取適量的上清液，緩慢加入等量的異丙醇，反復(fù)顛倒幾次，于冰上靜置15 min；⑥重復(fù)“④”的步驟；⑦棄上清，用0.1%的DEPC水將無水乙醇稀釋至終濃度為70%，加入1 ml稀釋后的無水乙醇充分洗滌RNA沉淀，經(jīng)4℃離心機(jī)離心10 min，12 000 r/min；⑧棄上清，將RNA沉淀置于室溫條件下放置5～10 min后，加入20～30 μl的DEPC水，4 ℃溶解過夜或者55～60℃水浴10 min促進(jìn)RNA溶解；⑨-80℃保存。癌旁正常組織采用相同的提取方法及處理方法。采用普通PCR儀檢測肝癌組織中的總RNA質(zhì)量。

1.2.4 qRT-PCR檢測 采用qRT-PCR法檢測miRNA-141相對表達(dá)量。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞并采用Trizol法提取總RNA，利用Nanodrop系統(tǒng)測定RNA樣品的濃度和純度，檢測260 nm和280 nm下光密度（optical density，OD）比值，判斷樣品純度是否符合實驗要求。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA質(zhì)量。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系：Master Mix 10 μl，上下游引物各 1 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共35個循環(huán)。以miRNA-141為特異性引物，以U6為內(nèi)參，按照2-△△Ct公式計算miRNA-141的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 MTT法檢測 待建立細(xì)胞系的細(xì)胞增殖數(shù)量達(dá)到80%時，消化細(xì)胞，以每孔3000個細(xì)胞的濃度接種于含200 μl培養(yǎng)基的96孔板中，保證細(xì)胞基本鋪滿整個孔，設(shè)置1、2、4、6 d四個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)設(shè)置5個復(fù)孔，并且設(shè)置只含培養(yǎng)基的空白孔。測量時每孔加入100 μl的完全培養(yǎng)基和20 μl的MTT溶液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入150 μl的DMSO，室溫下振蕩15 min，采用酶標(biāo)儀預(yù)熱，待藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚充分溶解后，利用預(yù)熱好的酶標(biāo)儀檢測各孔492 nm波長處的OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（對照組平均OD值-實驗組平均OD值）/對照組平均OD值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 平板克隆形成實驗 單個細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)6次及以上的分裂后形成克隆或者集落（細(xì)胞數(shù)目大于50個）的細(xì)胞群。平板克隆形成率是反映單個細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)，平板克隆形成率=（克隆形成數(shù)目/接種細(xì)胞總數(shù)目）×100%。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%時，消化、收集、重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。按照每孔1000個細(xì)胞的濃度接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6天，期間可根據(jù)情況適當(dāng)更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)6天后，棄培養(yǎng)基，D-Hanks液洗滌3次，甲醇固定15 min，棄甲醇，D-Hanks液洗滌1次，加入1 ml的0.4%結(jié)晶紫染色30 min，自來水沖洗，室溫干燥，倒置顯微鏡下觀察拍照，記錄細(xì)胞數(shù)目大于50個的克隆的數(shù)目。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法 以每孔約2×106個細(xì)胞將細(xì)胞均勻地鋪于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入不同的處理因素。棄去上清液并使用PBS清洗2次，每孔加入約200 μl的裂解液（其中，含2 μl的蛋白酶抑制劑和2 μl的磷酸酶抑制劑），冰上充分?jǐn)嚢柚良?xì)胞完全裂解。加入含有β-巰基乙醇的5×Loading buffer混勻，沸水煮15 min，-20℃保存。采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法檢測。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，采用5%的BSA封閉2 h，一抗封閉過夜，二抗封閉1 h，最后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminecence，ECL）試劑盒顯影。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，RNA條帶清晰，28S與18S的灰度值比例約為2∶1，RNA質(zhì)量符合實驗要求。采用Nanodrop系統(tǒng)測定RNA的純度，發(fā)現(xiàn)在260 nm和280 nm下OD值在1.8～2.0之間時，樣品純度符合實驗要求。

2.2 miRNA-141的表達(dá)情況

肝癌組織中miRNA-141的相對表達(dá)量為（0.33±0.15），低于癌旁正常組織中的（1.17±0.25），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.903，P＜0.05）。miRNA-141過表達(dá)組中miRNA-141的相對表達(dá)量為（0.32±0.03），對照組中miRNA-141的相對表達(dá)量為（1.23±0.16），陰性轉(zhuǎn)染組中miRNA-141的相對表達(dá)量為（1.26±0.21），3組miRNA-141的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=60.644，P＜0.01）。對照組和陰性轉(zhuǎn)染組中miRNA-141的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.254，P＞0.05）。

2.3 過表達(dá)miRNA-141對HepG 2細(xì)胞增殖能力的影響

過表達(dá)miRNA-141后，隨著時間的增加，HepG2細(xì)胞受到的增殖抑制作用增強(qiáng)，并呈時間依賴性。對照組、陰性轉(zhuǎn)染組和miRNA-141過表達(dá)組在不同時間點(diǎn)的HepG2細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。miRNA-141過表達(dá)組HepG2細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的增殖抑制率均明顯高于對照組和陰性轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組別不同時間點(diǎn)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖抑制率的比較（± s）

表1 不同組別不同時間點(diǎn)肝癌HepG 2細(xì)胞增殖抑制率的比較（± s）

注：a與對照組比較，P＜0.01；b與陰性轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.01

組別對照組陰性轉(zhuǎn)染組miRNA-141過表達(dá)組F值P值0.08±0.01 0.11±0.03 7.18±1.06a b 0.12±0.02 0.16±0.03 12.35±2.14a b 0.14±0.03 0.17±0.04 18.48±3.11a b 0.15±0.02 0.13±0.03 21.37±3.05a b 223.181 0.000 162.725 0.000 180.346 0.000 242.220 0.000 1 d 2 d 4 d 6 d

2.4 miRNA-14過表達(dá)對克隆形成能力的影響

過表達(dá)miRNA-141后，肝癌HepG2細(xì)胞的克隆形成能力被明顯抑制。miRNA-141過表達(dá)組的HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)目為（23.58±3.74），對照組的HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)目為（46.47±4.23），陰性轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)目為（46.58±5.27），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=39.468，P＜0.01）。對照組和陰性轉(zhuǎn)染組的HepG2細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.145，P＞0.05）。

2.5 HOXD-AS 1蛋白表達(dá)情況

miRNA-141過表達(dá)組中HOXD-AS1蛋白的相對表達(dá)量為（1.00±0.13），對照組中HOXD-AS1蛋白的相對表達(dá)量為（5.77±0.55），陰性轉(zhuǎn)染組中HOXD-AS1蛋白的相對表達(dá)量為（5.58±0.46），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=206.052，P＜0.01）。對照組和陰性轉(zhuǎn)染組中HOXD-AS1蛋白的相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.593，P＞0.05）。

3 討論

近年來，人類發(fā)現(xiàn)了許多不同種類的RNA分子，其中，最重要的是小RNA分子的發(fā)現(xiàn)，有些小RNA分子能夠直接調(diào)控某些基因的開關(guān)，從而控制細(xì)胞的生長。其中，miRNA是廣泛存在于真核生物中的一種短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，是由19～25個核苷酸組成的單鏈RNA，具有高度保守性。與此同時，miRNA的表達(dá)具有組織特異性和階段特異性，在不同的組織中有不同miRNA的表達(dá)，在相同組織的不同階段也有不同miRNA的表達(dá)，它們通過在RNA代謝的各個層面進(jìn)行調(diào)控，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)。肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，人們常說的肝癌多指的是原發(fā)性肝癌，是臨床最常見的惡性腫瘤之一。迄今為止，越來越多的研究表明，miRNA與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在之前的研究中，發(fā)現(xiàn)了miRNA-141參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如肝癌、膀胱癌、腎癌和胃癌等。雖然既往有很多關(guān)于miRNA-141的研究，但是miRNA-141在肝癌中的作用機(jī)制及臨床價值尚不明確，因此，本研究就miRNA-141在肝癌組織中的表達(dá)及其在細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探索，結(jié)果顯示，miRNA-141在肝癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)存在差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，過表達(dá)miRNA-141后，肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力被明顯抑制。據(jù)文獻(xiàn)報道，肝癌組織中HOXD-AS1的表達(dá)明顯上調(diào)，且可通過激活SOX4促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[16]。

綜上所述，過表達(dá)miRNA-141后，HOXD-AS1的表達(dá)也被抑制，由此推測，miRNA-141對肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響可能與靶向HOXDAS1有關(guān)。