酵母靜息細(xì)胞耦合原位分離技術(shù)連續(xù)轉(zhuǎn)化2-苯乙醇

黃筱萍, 劉蘭，熊大維，金丹鳳，黃國昌，顧斌濤，李鵬

(江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌，330029)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，簡稱2-PE)是一種具有玫瑰氣味的芳香醇，廣泛應(yīng)用于日化、食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中。2-PE和乙醇對酵母的毒性是生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-PE中產(chǎn)物濃度不高的主要原因[1-4]。通過原位產(chǎn)物分離(in situ product removal, ISPR)技術(shù)從發(fā)酵液中萃取和吸附產(chǎn)物2-PE，維持產(chǎn)物濃度在較低水平，避免產(chǎn)物抑制，是提高2-PE產(chǎn)量的一種主要方法[5-6]。采用有機溶劑兩相萃取技術(shù)原位轉(zhuǎn)移2-PE可一定程度解決產(chǎn)物抑制效應(yīng), 有機溶劑黏度大,產(chǎn)品分離復(fù)雜，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中必然會增加發(fā)酵工藝的復(fù)雜性和成本[7-8]。ESCHMANN等在酵母細(xì)胞培養(yǎng)過程中用聚丙二醇1200作為萃取劑，有機相和水相中的2-PE產(chǎn)量分別達(dá)到26.5 g/L和0.3 g/L[9]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大孔樹脂進(jìn)行產(chǎn)物吸附可有效提高2-PE的產(chǎn)量[10]。關(guān)昂等采用大孔樹脂F(xiàn)D0816為吸附介質(zhì)，2-PE終濃度達(dá)到12.8 g/L[11]，WANG等以FD0816樹脂作為萃取劑對S.cerevisiaeGivR-UV3進(jìn)行半連續(xù)培養(yǎng)，通過控制葡萄糖流量和更換發(fā)酵液中的樹脂，2-PE總產(chǎn)量達(dá)32.5 g/L[12]，在發(fā)酵液中加入樹脂進(jìn)行ISPR生物轉(zhuǎn)化，雖然取得了較高的產(chǎn)量，但樹脂需要滅菌和經(jīng)常更換，菌體與樹脂難分離，且發(fā)酵液易污染雜菌，難以實現(xiàn)真正的連續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。本研究采用酵母靜息細(xì)胞作為酶的載體，進(jìn)行靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化-微濾膜分離菌體-大孔吸附樹脂吸附產(chǎn)物的ISPR技術(shù)合成轉(zhuǎn)化2-PE，可有效解決生長細(xì)胞轉(zhuǎn)化液組分復(fù)雜副產(chǎn)物多、易污染、樹脂難分離、操作復(fù)雜、以及有機廢水排放量大等問題，大幅提高2-PE的產(chǎn)量[13]。產(chǎn)物吸附在樹脂柱中，樹脂無需分離和滅菌，ISPR運行不需要在無菌條件下進(jìn)行，細(xì)胞可多批次重復(fù)使用，可進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)化合成2-PE，具有潛在的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

菌種SaccharomycescerevisiaeH003由本實驗室篩選獲得，現(xiàn)保存于江西省科學(xué)院微生物研究所。

1.1.1 主要試劑

L-苯丙氨酸購自河北冀海生物科技有限公司，純度99.5%；2-PE標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；甲醇為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純,HZ-816大孔樹脂(上海華震科技有限公司)。

1.1.2 主要設(shè)備

2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；HC-C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，美國Agilent公司；7890B氣相色譜儀(FID檢測器)，美國Agilent公司，DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)，美國Agilent公司； H2500R-2高速冷凍離心機，湖南湘儀；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物技術(shù)公司；平板式微濾裝置，Pellicon2 Mini Cassette微濾膜(孔徑0.45 μm),美國KOCH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基值g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉 3，麥芽汁 3，pH自然；

細(xì)胞增殖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉 3，麥芽汁 3，pH值為5.8～6.2；

從斜面挑取1～2環(huán)菌苔至30 mL種子液中，于28 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，接種至150 mL種子液中于相同條件進(jìn)行擴大培養(yǎng)20 h后，接入裝有3 L種子液的發(fā)酵罐中進(jìn)行增殖培養(yǎng)20 h,培養(yǎng)條件28 ℃、轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣量0.25 vvm。

1.2.2 靜息細(xì)胞制備

細(xì)胞培養(yǎng)液于8 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液洗滌細(xì)胞2次，將菌體重懸于緩沖液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 5 L罐靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件

用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液配制不同濃度的靜息細(xì)胞液，加入底物L(fēng)-苯丙氨酸(L-Phe)和輔助底物乙醇，于28 ℃、200～400 r/min、通氣量0.2～0.5 vvm進(jìn)行轉(zhuǎn)化24 h。

1.2.4 5 L生物反應(yīng)器-微濾膜系統(tǒng)-樹脂柱產(chǎn)物吸附串聯(lián)ISPR連續(xù)轉(zhuǎn)化試驗

取一定量的樹脂預(yù)處理后用 0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液分裝兩根樹脂柱，連接5 L生物反應(yīng)器-超濾膜系統(tǒng)-樹脂柱吸附裝置。將2.5～3.0 L 0.8 g/L靜息細(xì)胞液置于5 L生物反應(yīng)器中，加入L-Phe10 g/L和乙醇16 g/L，于優(yōu)化的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。當(dāng)轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物濃度高于2.8 g/L時，啟動超濾膜系統(tǒng)和樹脂柱裝置進(jìn)行產(chǎn)物原位分離，超濾膜濃液返回反應(yīng)器中，清液進(jìn)入樹脂柱進(jìn)行產(chǎn)物吸附，通過樹脂柱的清液再經(jīng)在線過濾器后泵回反應(yīng)器中，當(dāng)反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化液的2-PE濃度低于0.5 g/L結(jié)束料液循環(huán)。當(dāng)轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物濃度再次高于2.8 g/L時，再進(jìn)行新的循環(huán)吸附。如此連續(xù)轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化速率低于0.15 g/(L·h)時，終止轉(zhuǎn)化。細(xì)胞離心分離或微濾膜分離后懸浮于緩沖液中，用于下一批次的轉(zhuǎn)化。由于靜息細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中仍有少量的出芽生殖，需對細(xì)胞濃度進(jìn)行監(jiān)控，當(dāng)細(xì)胞濃度高于1.1 g/L時，適量分流一部分細(xì)胞至罐外或移至另一反應(yīng)器中，同時補入適量的緩沖液和底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，如此2個反應(yīng)罐切換操作，實現(xiàn)連續(xù)轉(zhuǎn)化吸附的生產(chǎn)過程。

1.2.5 靜息細(xì)胞重復(fù)利用活性比較

每次轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將靜息細(xì)胞離心或用微濾膜過濾收集菌體細(xì)胞，重新懸浮于緩沖液中，置4 ℃冰箱保存。待下一批次轉(zhuǎn)化時使用。采用多次使用的細(xì)胞與新制備的細(xì)胞在相同轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行ISPR的試驗，測定轉(zhuǎn)化速率的變化和催化穩(wěn)定性。

1.2.6 產(chǎn)物的洗脫和收集

吸附在樹脂柱中的2-PE用1.5～2.5倍樹脂柱體積的乙醇洗脫，洗脫流速為3.0～4.5 m3/[m3(柱容)·h]，得至約2.0倍樹脂體積的2-PE粗品。

1.2.7 反相高效液相色譜法測定L-PHE含量

樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋，于HPLC分析。流動相為V(甲醇)∶V(水)=50%∶50%，流速為1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.8 氣相色譜法測定2-PE和乙醇含量條件[14]

樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋，用0.22 μm聚醚有機濾膜過濾。分析條件：載氣(N2)、氫氣、空氣流速分別為5、30、300 mL/min；進(jìn)樣器和檢測器溫度均為250 ℃，升溫程序：80 ℃(2 min) →升溫速率(20 ℃/min)→220 ℃(3 min)；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：10∶1；檢測器：FID；進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果和分析

2.1 細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化合成2-PE的影響

利用酵母細(xì)胞靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-PE，細(xì)胞作為艾氏途徑催化反應(yīng)酶的載體，細(xì)胞濃度直接影響參與反應(yīng)的酶量，進(jìn)而影響其催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率。用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液配制不同的細(xì)胞濃度，加入L-Phe 8 g/L、乙醇16 g/L，于28 ℃、200 r/min，0.3 vvm條件下轉(zhuǎn)化24 h，結(jié)果見圖1。

圖1 細(xì)胞濃度對轉(zhuǎn)化合成2-PE合成的影響Fig.1 Effect of cell concentration on 2-PE production bybioconversion

結(jié)果表明，細(xì)胞濃度低于0.8 g/L時，2-PE產(chǎn)量較低，當(dāng)初始細(xì)胞濃度為1.0 g/L時，2-PE產(chǎn)量達(dá)到最高，繼續(xù)提高細(xì)胞濃度不能增加2-PE的產(chǎn)量，這可能是由于過多的菌體導(dǎo)致溶氧供應(yīng)不足，同時影響溶液的傳質(zhì)效率，不利于轉(zhuǎn)化進(jìn)行，因此細(xì)胞量控制在0.8～1.1 g/L比較合適。

2.2 攪拌速率和通氣量對轉(zhuǎn)化合成2-PE的影響

在靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中需要一定的氧的參與，攪拌速率對底物與產(chǎn)物的傳質(zhì)有一定的影響，分別考察了在不同的通氣量和攪拌速率下對產(chǎn)物生成的影響。圖2為靜息細(xì)胞濃度為1.0 g/L，L-Phe8 g/L，乙醇16.5 g/L，于28℃、300 r/min、不同通氣量條件下轉(zhuǎn)化24 h的2-PE產(chǎn)量。圖3為在相同條件下，靜通氣量為0.3 vvm，不同攪拌速率轉(zhuǎn)化合成2-PE產(chǎn)量。

圖2 通氣量對2-PE產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of ventilate volume on 2-PE bioconversion

當(dāng)通氣量達(dá)0.2 vvm，2-PE產(chǎn)量明顯提高，通氣量達(dá)到0.3 vvm時，2-PE產(chǎn)量達(dá)到最高，繼續(xù)提高通氣量，產(chǎn)量沒有提高。當(dāng)攪拌速率為300 r/min時產(chǎn)量明顯增加，繼續(xù)增加攪拌速率，產(chǎn)量變化不大，優(yōu)化的通氣量和攪拌速率為0.3 vvm和300 r/min。

圖3 攪拌速率對2-PE產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of stir speed on 2-PE bioconversion

2.3 單罐產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化試驗

在5 L反應(yīng)罐中加入0.8 g/L靜息細(xì)胞懸浮液3.0 L，加入底物和輔助底物，在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。用緩沖液裝填2支樹脂柱，每柱裝有大孔樹脂550 g，柱體積為744.5 mL。每20～24 h開啟ISPR裝置進(jìn)行原位產(chǎn)物分離，定時取樣測定底物、輔助底物及產(chǎn)物濃度，根據(jù)濃度的變化適當(dāng)補加底物和輔助底物，使底物和輔助底物濃度分別控制在3～10 g/L和5～16 g/L之間，同時監(jiān)控細(xì)胞濃度，當(dāng)罐內(nèi)細(xì)胞濃度高于 11 g/L時，將適當(dāng)?shù)募?xì)胞移出罐外，同時補入適當(dāng)?shù)木彌_液以控制細(xì)胞濃度在7～11 g/L之間。轉(zhuǎn)化結(jié)束后離心收集細(xì)胞，置4 ℃冰箱保存。用約1.5倍樹脂柱體積的純水置換樹脂柱中的轉(zhuǎn)化液，再用約1.5～2.0倍樹脂柱體積的乙醇洗脫產(chǎn)物。表1為分別連續(xù)運行不同時間的底物添加量、產(chǎn)量、摩爾轉(zhuǎn)化率和平均轉(zhuǎn)化速率。

表1 靜息細(xì)胞單罐運行ISPR轉(zhuǎn)化合成2-PE試驗結(jié)果Table 1 The result of ISPR continuous bioconversion of 2-PE by resting cell in single bioreactor

隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，2-PE產(chǎn)量亦顯著增加，連續(xù)運行145 h后，2-PE總產(chǎn)量達(dá)72.18 g，折算產(chǎn)量達(dá)24.06 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為79.34%。平均轉(zhuǎn)化速率隨著轉(zhuǎn)化時間的延長略有下降，這可能是因為隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，罐內(nèi)細(xì)胞濃度增加，在66 h后細(xì)胞濃度可達(dá)到11 g/L以上，在ISPR運行過程中，需將細(xì)胞濃液分流一部分體積的細(xì)胞至罐外，再另補加相同體積的緩沖液以維持罐內(nèi)較適的細(xì)胞濃度，轉(zhuǎn)化時間越長， 移出罐外的細(xì)胞越多，而移出罐外的細(xì)胞液中含有較高濃度的L-Phe，這對摩爾轉(zhuǎn)化率和平均轉(zhuǎn)化速率會有一定的影響，為提高ISPR的運行穩(wěn)定性和細(xì)胞的利用率，可以采用雙罐同時運行的方式進(jìn)行連續(xù)ISPR運行。

2.4 雙罐產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化試驗

在單罐運行ISPR裝置中增加1個轉(zhuǎn)化罐， ISPR運行68 h將約1 L左右靜息細(xì)胞濃液轉(zhuǎn)移至第2罐中，在2個罐中分別補入適量的緩沖液和底物等在相同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)用，之后每20～24 h轉(zhuǎn)入少量的細(xì)胞至第2罐中，至體積達(dá)到3 L左右結(jié)束轉(zhuǎn)化，結(jié)果見表2。

表2 靜息細(xì)胞雙罐運行ISPR轉(zhuǎn)化合成2-PE試驗結(jié)果Table 2 The result of ISPR continus bioconversion of 2-PE by resting cell in double bioreactors

雙罐ISPR分別運行了121.3 h和144.7 h，在相同時間內(nèi)產(chǎn)量比單罐有顯著提高，產(chǎn)量分別增加12.75%和24.10%，隨著轉(zhuǎn)化時間增加，產(chǎn)量有可能得到更大幅度的提高。摩爾轉(zhuǎn)化率和平均轉(zhuǎn)化速率也明顯提高，摩爾轉(zhuǎn)化率均達(dá)80%以上，平均轉(zhuǎn)化速率達(dá)0.2 g/(L·h)。

2.5 靜息細(xì)胞重復(fù)利用活性比較

取上述試驗置冰箱保存的重復(fù)使用10批次的靜息細(xì)胞液(濃度8 g/L)2.5 L,新制備靜息細(xì)胞液(濃度8 g/L)2.5 L分別加入5 L罐中進(jìn)行ISPR轉(zhuǎn)化試驗，在相同的條件下進(jìn)行單罐轉(zhuǎn)化96 h，運行期間細(xì)胞未移出罐外，運行52 h和80 h后，在2罐中分別加入緩沖液約400 mL和300 mL，表3為2罐的細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-PE的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化速率。

表3 不同使用批次的靜息細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)化2-PE結(jié)果Table 3 The result of ISPR bioconversion of 2-PE by different batch resting cell

注：*試驗罐1為新制靜息細(xì)胞液，試驗罐2為重復(fù)使用10批次的靜息細(xì)胞液。

重復(fù)利用10次的靜息細(xì)胞液與新制備的靜息細(xì)胞液在單罐中連續(xù)運行96 h，最終2-PE產(chǎn)量分別達(dá)16.67 g/L和16.53 g/g，平均轉(zhuǎn)化速率亦未明顯下降，這表明靜息細(xì)胞在進(jìn)行重復(fù)利用，生物活性沒有明顯下降，在實際生產(chǎn)中可大大降低細(xì)胞培養(yǎng)和靜息細(xì)胞制備的次數(shù)。

3 小結(jié)

通過在5 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，確定了酵母靜息細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件為：細(xì)胞濃度8～11 g/L,通氣量0.3 vvm，攪拌速率300 r/min 。在優(yōu)化的條件下進(jìn)行ISPR連續(xù)生物轉(zhuǎn)化2-PE，單罐分別連續(xù)運行72、96、120、145 h,隨著轉(zhuǎn)化時間的增加，2-PE產(chǎn)量逐漸增加，最高罐產(chǎn)量達(dá)24 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率均在80%左右，平均轉(zhuǎn)化速率在0.165～0.18 g/(L·h)之間。雙罐運行144 h，2-PE在產(chǎn)量達(dá)29.86 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率和平均轉(zhuǎn)化速率上比單罐運行均有所提高，靜息細(xì)胞重復(fù)使用10批次，產(chǎn)量和平均轉(zhuǎn)化速率沒有明顯下降。

由于靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢，目前在天然化合物的生物合成、藥物前體化合物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域已展開了靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成的研究[15-16]，而生物轉(zhuǎn)化合成2-PE還主要集中在采用生長細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化[10-12]。生長細(xì)胞在發(fā)酵液中加入樹脂進(jìn)行ISPR生物轉(zhuǎn)化合成2-PE，雖然可獲得較高的產(chǎn)量，但樹脂需要滅菌，反復(fù)的高溫滅菌會影響樹脂的吸附效率，樹脂難以回收；且培養(yǎng)液中含大量糖、酵母粉等有機物，易污染雜菌，有機廢水排放量大，導(dǎo)致生長細(xì)胞在實際生產(chǎn)過程中進(jìn)行ISPR技術(shù)難以實現(xiàn)。采用酵母靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-PE的優(yōu)勢在于轉(zhuǎn)化液組分非常簡單(只含底物、乙醇和少量無機鹽)、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品易于分離純化；細(xì)胞可以重復(fù)利用，不用頻繁培養(yǎng)和制備細(xì)胞，大大減少了發(fā)酵有機廢水排放，是一種清潔的生產(chǎn)工藝。尤其是靜息細(xì)胞可長時間保持生物活性，無需在無菌條件下運行，操作簡單，這是實現(xiàn)ISPR連續(xù)運行的關(guān)鍵，在未來工業(yè)上的應(yīng)用具有明顯的優(yōu)勢。