甘草甜素促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113的凋亡

周 峰，陳 虎，曾 靜

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院 口腔科, 河南 南陽(yáng) 473000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔額面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球新增病例超過(guò)26萬(wàn)例，其中死亡人數(shù)約有13萬(wàn)例[1- 2]?？谇击[狀細(xì)胞癌的發(fā)病率相對(duì)較低，但中國(guó)由于人口基數(shù)大，每年的新增病例約有4.56萬(wàn)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，并呈現(xiàn)年輕化現(xiàn)象[3]。目前手術(shù)聯(lián)合化療方法是提高OSCC患者生存率的有效方法，臨床上主要使用順鉑、氟尿嘧啶和阿霉素對(duì)其進(jìn)行化療[4]，然而，這些藥物的毒副作用大，且容易產(chǎn)生耐藥性。

甘草甜素(glycyrrhizin, GL)又稱甘草酸，是從藥用植物甘草的根莖中提取的三萜類皂苷。研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用。甘草甜素通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生成，減少血管的生成，從而抑制大鼠結(jié)腸癌前病變[5]。有國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)甘草甜素通過(guò)增加junB的表達(dá)刺激人肝癌細(xì)胞系JUNB的表達(dá)[6]。由于尚未有文獻(xiàn)證明甘草甜素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用，本文研究甘草甜素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113凋亡作用，并探討初步的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113(上海邦景實(shí)業(yè)有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(上海研卉生物科技有限公司)；甘草甜素(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，純度>98%)，用二甲基亞砜(終濃度<0.01%)溶解成相應(yīng)濃度；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物有限公司)；線粒體分離試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；Cyt-C，β-actin，Cox Ⅳ抗體均(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113加入含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素溶液的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(control)；溶劑對(duì)照組(vehicle)，加入相應(yīng)體積溶劑；藥物干預(yù)組(GL)，給予40 μmol/L甘草甜素處理24 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入甘草甜素使最終濃度分別為0、10、20、40與80 μmol/L，培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT試劑20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)液體，每孔加入DMSO 150 μL，搖床上低速振蕩10 min，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定：將處于對(duì)數(shù)增殖期的Tca8113細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，貼壁培養(yǎng)過(guò)夜，采用甘草甜素處理后，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸去至離心管，加入0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃孵育5 min，終止消化，吹打細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，收集細(xì)胞，用PBS重懸并計(jì)數(shù)，使?jié)舛葹?×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；取100 μL細(xì)胞懸液依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，輕輕混勻后室溫下避光孵育15 min，加入200 μL的上樣緩沖液，設(shè)置流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，用熒光顯微鏡檢測(cè)，將細(xì)胞混合液離心，取細(xì)胞沉淀涂片，再進(jìn)行觀察。

1.2.4 線粒體提?。河镁€粒體分離試劑盒提取細(xì)胞中的線粒體，操作如下：收集約1×107個(gè)細(xì)胞，于冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)，4 ℃ 800×g，離心5 min，棄上清。加入試劑A，離心10 s，冰上孵育1 min，加入試劑B，離心30 s，冰上孵育4 min，其中每隔1 min渦旋振蕩1次，加入試劑C，800×g，4 ℃離心5 min。沉淀為線粒體部分。上清，4 ℃ 10 000×g，離心5 min，為胞質(zhì)部分。

1.2.5 免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后用10%聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗室溫孵育1 h，洗膜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像，分析條帶灰度值，計(jì)算目的和內(nèi)參條帶的灰度值。

1.2.6 線粒體跨膜電位檢測(cè)： 線粒體跨膜電位檢測(cè)根據(jù)跨膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)JC- 1熒光染料指示劑檢測(cè)線粒體膜電位的改變，并在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光與綠色熒光強(qiáng)度，使用兩者熒光強(qiáng)度比值代表線粒體膜電位的改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甘草甜素抑制Tca8113細(xì)胞的增殖

Tca8113細(xì)胞的存活率隨著甘草甜素濃度增加而下降，當(dāng)甘草甜素濃度為40 μmol/L時(shí)，隨著甘草甜素濃度增大，Tca8113細(xì)胞的存活率變化不明顯，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用甘草甜素濃度為40 μmol/L進(jìn)行試驗(yàn)(圖1)。

圖1 甘草甜素對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率變化的影響Fig 1 Effect of glycyrrhizin on the survival rate of Tca8113 cells

2.2 甘草甜素對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

Tca8113細(xì)胞的凋亡率顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 甘草甜素對(duì)線粒體膜電位的影響

空白對(duì)照組的Tca8113細(xì)胞紅色熒光很強(qiáng)，綠色熒光極弱，加入甘草甜素干預(yù)后， Tca8113細(xì)胞的紅色熒光明顯減弱，綠色熒光明顯加強(qiáng)(圖3)。

2.4 甘草甜素對(duì)Cyt-C蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示加入甘草甜素培養(yǎng)后的細(xì)胞線粒體(mito)中Cyt C的蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而胞質(zhì)(Cyto)中Cyt C的蛋白表達(dá)則顯著升高(P<0.05)，導(dǎo)致胞質(zhì)與線粒體中Cyt C的比值增加(P<0.05)(圖4)。

5 討論

隨著甘草甜素濃度的增大，甘草甜素對(duì)Tca8113細(xì)胞存活率的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)甘草甜素濃度到達(dá)40 μmol/L時(shí)，繼續(xù)增加藥物濃度，Tca8113細(xì)胞的存活率不再發(fā)生明顯變化，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用40 μmol/L甘草甜素進(jìn)行研究。提示甘草甜素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113的增殖具有抑制作用。另外，流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘草甜素能夠誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的凋亡。

凋亡是指細(xì)胞在一定條件下受到刺激信號(hào)，經(jīng)凋亡基因調(diào)控，并由一系列酶參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的死亡過(guò)程。其中涉及不同的基因調(diào)控與表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)體系的正負(fù)調(diào)節(jié)等作用[7]。研究顯示， 無(wú)論是死亡受體信號(hào)途徑，或是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑，最終都會(huì)激活線粒體凋亡途徑[8]。線粒體凋亡途徑主要是以線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放為中心環(huán)節(jié)，當(dāng)MPTP開(kāi)放后，各種離子和可溶性物質(zhì)進(jìn)入線粒體中，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度耗散，從而降低線粒體的跨膜電位，進(jìn)一步引起Cyt C和其他凋亡活性物質(zhì)釋放入胞質(zhì)中，引起下游caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。JC- 1是常用的線粒體膜電位指示劑，JC- 1形成聚合物后，產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位降低，JC- 1則形成單體，產(chǎn)生綠色熒光；因此，以紅色熒光與綠色熒光的比值代表線粒體膜電位的異常[10]。研究發(fā)現(xiàn)采用甘草甜素干預(yù)后，與對(duì)照組相比，Tca8113細(xì)胞的紅色熒光顯著減弱，紅色熒光與綠色熒光比值顯著降低，表明線粒體膜的通透性改變，提示Cyt C從線粒體內(nèi)釋放到胞質(zhì)中，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，甘草甜素可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的凋亡。

*P<0.05 compared with control and vehicle group

*P<0.05 compared with control and vehicle group

*P<0.05 compared with control and vehicle group

綜上所述，甘草甜素對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113具有抑制增殖的作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)線粒體凋亡途徑有關(guān)，詳細(xì)的機(jī)制有待深入研究。