不同麻醉狀態(tài)對大鼠膀胱測壓的影響

何育霖,李云龍,文一博,何翔飛,馮錦錦,馬 源,汪熙正,邢 棟,李 琦,陳 燕,徐鵬超,翟榮群,文建國

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，小兒尿動力學中心和河南省小兒尿動力國際聯(lián)合實驗室，河南鄭州 450052)

動物實驗為解決臨床問題做出了巨大的貢獻，很多疾病要通過動物實驗研究其發(fā)生機制，從而指導藥物的研發(fā)和疾病診治[1]。隨著泌尿外科學的不斷發(fā)展，動物實驗在泌尿系統(tǒng)疾病研究中的作用也越來越重要[2]。下尿路功能障礙是泌尿外科研究中的一個重要方向，比如膀胱過度活動癥(overactive bladder，OAB)、下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms,LUTS)、神經源性膀胱(neurogenic bladder,NB)等等[3-6]。以大鼠為研究對象的動物實驗在這些疾病的發(fā)病機制及診療方法的研究中發(fā)揮著巨大的作用。而對這些疾病動物模型的研究，一個必不可少的膀胱功能檢測方法就是大鼠的膀胱測壓技術，因為它是目前檢測膀胱功能的金標準[7-8]。目前常用的大鼠膀胱測壓方法是麻醉狀態(tài)下膀胱測壓和清醒狀態(tài)下膀胱測壓[9-10]。但不同的麻醉狀態(tài)(淺麻醉和深麻醉)對尿動力結果可能會有一定的影響，因此，了解大鼠在兩種狀態(tài)下膀胱測壓結果的差異，對我們研究大鼠模型的膀胱功能十分重要，進而使動物模型更好地服務于臨床。然而目前國內外關于不同麻醉狀態(tài)對大鼠膀胱測壓的影響及與清醒狀態(tài)膀胱測壓結果比較的研究較少，故本研究擬探討不同麻醉狀態(tài)下大鼠的膀胱測壓結果與清醒狀態(tài)膀胱測壓結果的差異，為動物膀胱測壓研究提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對象18～24周齡SD雄性大鼠13只體重350～400 g，由河南省動物中心提供。

1.2材料和儀器膀胱測壓導管:一次性使用。靜脈輸液針(蘇云)后面的軟管(外徑2.5 mm,內徑1.5 mm)，軟管的一端用火機燒成小領口(可以預防軟管從膀胱脫出)。膀胱測壓裝置：BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，微量注射泵(德國貝朗)。麻醉藥物:水合氯醛(科密歐國藥集團化學試劑有限公司產品)。

1.3大鼠麻醉狀態(tài)評定應用ANTUNES等[11]報道的大鼠肢體反應麻醉評分法評定大鼠的麻醉深度(評分表見表1),1分為深麻醉狀態(tài)，4分為淺麻醉狀態(tài)。采用10%水合氯醛氯化鈉水溶液0.3 mL/100 g麻醉大鼠，麻醉生效后，對大鼠行膀胱造瘺術，術后根據(jù)大鼠的肢體行為給大鼠進行麻醉評分，對于評分為1分的直接進行膀胱測壓，大于1分的給大鼠適當追加麻醉藥使其評分達到1分后再進行膀胱測壓。深麻醉測壓后繼續(xù)觀察大鼠，當大鼠恢復至評分為4分時再給大鼠進行淺麻醉狀態(tài)膀胱測壓。

1.4大鼠膀胱測壓

1.4.1大鼠膀胱頂造瘺 麻醉(10%水合氯醛氯化鈉水溶液0.3 mL/100 g麻醉)生效后，行下腹正中切口長約1～2 cm，顯露膀胱頂部，先用4-0帶線滌綸縫合針(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品辜負有限公司)在膀胱頂部先荷包式縫合一周，在荷包中間用4.5號針頭于膀胱頂部刺穿膀胱后用顯微鑷尖擴張穿刺孔，將靜脈輸液針軟管袖頭通過穿刺孔插入膀胱，之后扎緊荷包，在劍突下1.5 cm處皮膚切開長約1 cm小口，用16號針頭穿刺腹壁后將軟管由穿刺孔從腹腔引出，并于穿刺孔處用4號絲線將軟管固定一針，之后用4號絲線縫合腹直肌前鞘及下腹部切口，用無菌紗布保護上腹部切口翻轉大鼠至俯臥位在頸部正中用剪刀剪開長約0.7 cm的小口，用眼科剪分離皮下，然后翻轉大鼠至仰臥位，在上腹部切口處于皮下用彎鉗分離隧道至頸部切口，將軟管從劍突下出口經皮下隧道在頸部背側穿出，并于頸部切口用4號絲線固定一針。然后翻轉大鼠至仰臥位用4號絲線縫合上腹部切口，大鼠膀胱造瘺完成。

1.4.2深麻及淺麻程度下大鼠膀胱測壓 將造瘺后的大鼠俯臥位固定四肢，將T型管一個側管連接灌注泵，另一側管連接膀胱測壓管，T型管的匯總管連接BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)的測壓通道。微量泵應用20 mL注射器作為灌注容器。將大鼠恥骨聯(lián)合位置放置于測壓傳感器插頭位置等高，打開電腦BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)界面，應用的通道設置為壓力感受通道，啟動壓力檢測，開啟灌注泵將T型管軟管中的空氣排凈，將膀胱測壓管在大鼠操作臺平面(相當于大鼠恥骨聯(lián)合位置)調零后與大鼠背側造瘺管連接，開啟灌注泵，以0.1 mL/min的速度向膀胱灌注18 ℃的生理鹽水，在BL-420/820生物機能實驗系統(tǒng)記錄膀胱壓力曲線。觀察至壓力曲線穩(wěn)定后出現(xiàn)3個排尿周期，同時觀察大鼠尿道口的排尿情況。在大鼠深麻及淺麻醉狀態(tài)時記錄大鼠的膀胱壓力曲線，并觀察大鼠尿道口的排尿情況。

1.4.3清醒狀態(tài)下大鼠膀胱測壓 術后第2天大鼠已徹底清醒并能自如活動，將大鼠放置于限制性鼠籠中，同法準備好大鼠膀胱測壓設備后將大鼠的背側膀胱造瘺管塞子取下，將膀胱測壓管端口對準鼠籠底部(相當于大鼠恥骨聯(lián)合位置)調零后與大鼠背側造瘺管連接，膀胱灌注生理鹽水速度0.1 mL/min,開啟灌注泵開始膀胱測壓，同時觀察膀胱排尿情況。

1.5觀察指標大鼠不同狀態(tài)下的充盈期膀胱基礎壓、排尿期最大膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量和膀胱順應性。充盈期基礎膀胱壓：大鼠每次排完尿液后的膀胱壓力；功能膀胱容量：兩次排尿間隔期間的膀胱容量改變值；膀胱順應性:膀胱充盈期的值。測壓方法符合國際尿控協(xié)會規(guī)定的膀胱壓力容積測定的基本原則。

2 結 果

2.1深麻醉狀態(tài)下膀胱測壓結果13只大鼠均手術順利，無大鼠死亡。大鼠在深麻醉狀態(tài)下，膀胱沒有收縮力，膀胱充盈到一定程度出現(xiàn)充盈性尿失禁，膀胱漏點壓(bladder leak point pressure，BLPP)為(33.101±7.189)cmH2O(圖1)，該狀態(tài)下的膀胱順應性為(0.017 4±0.012 6) mL/cmH2O。

2.2淺麻醉狀態(tài)下的膀胱測壓結果大鼠在淺麻醉狀態(tài)下有意識存在，大鼠膀胱可瞬時收縮，大鼠均可自行排尿。該狀態(tài)下大鼠的基礎膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量、膀胱順應性、排尿期最大膀胱壓分別為：(11.490±7.312)cmH2O、(156.306±81.327)s、(0.261±0.136)mL、(0.089 4±0.092 2)mL/cmH2O、(32.027±6.309)cmH2O(表2)。

2.3清醒狀態(tài)下的膀胱測壓結果清醒狀態(tài)下大鼠的基礎膀胱壓、排尿間隔、功能膀胱容量、膀胱順應性、排尿期最大膀胱壓分別為：(10.777±4.386)cmH2O、(237.057±124.388)s、(0.389±0.202)mL、(0.104±0.136)mL/cmH2O、(38.144±7.974)cmH2O。

2.4大鼠三個不同狀態(tài)下膀胱測壓結果配對t檢驗結果顯示：淺麻醉狀態(tài)下大鼠的排尿期最大膀胱壓顯著小于清醒狀態(tài)[(32.027±6.309)cmH2Ovs.(38.144±7.974)cmH2O,P<0.05]，同時淺麻醉時的排尿間隔和膀胱功能容量也顯著小于清醒狀態(tài)[(156.306±81.327)svs. (237.057±124.388)s，(0.261±0.136)mLvs.(0.389±0.202)mL),P<0.05],在淺麻醉和清醒狀態(tài)大鼠的膀胱順應性和基礎膀胱充盈壓沒有顯著性差異[(0.089 4±0.092 2)mL/cmH2Ovs.(0.104±0.136)mL/cmH2O，(11.490±7.312)cmH2Ovs. (10.777±4.386)cmH2O,P>0.05]，深麻醉狀態(tài)下的膀胱順應性[(0.017 4±0.012 6)mL/cmH2O]較淺麻醉[(0.089 4±0.092 2) mL/cmH2O]及清醒狀態(tài)[(0.104±0.136) mL/cmH2O]低(P<0.05)。比較結果詳見表3、圖1。

表1麻醉評分標準

分值身體表現(xiàn)1被鉗夾刺激肢體沒有反應,呼吸深而慢。2被鉗夾刺激肢體僅有輕度肌顫但不能活動。3被鉗夾刺激肢體有輕度的蜷縮活動,但身體無法移動。4 被鉗夾刺激肢體有明顯的蜷縮活動,偶爾大鼠會移動身體到別處,呼氣頻率加快。5 開始有輕度的胡須活動,角膜刺激時有眨眼動作,被鉗夾肢體快速蜷縮并有其他肢體的快速活動及身體移動。

1分：深麻醉狀態(tài)；2～3分：適度麻醉狀態(tài)；4分：淺麻醉狀態(tài)；5分：輕微麻醉狀態(tài)。

麻醉狀態(tài)基礎膀胱壓(cmH2O)排尿間隔(s)功能膀胱容量(mL)膀胱順應性(mL/cmH2O)排尿期最大膀胱壓(cmH2O)淺麻醉11.490±7.312156.306±81.3270.261±0.1360.089 4±0.092 232.027±6.309深麻醉---0.017 4±0.012 6-清醒10.777±4.386237.057±124.3880.389±0.2020.104±0.13638.144±7.974

表3 配對t檢驗結果(n=13)

*有顯著性差異。

圖1 同一只大鼠不同狀態(tài)下的膀胱測壓結果

3 討 論

大鼠膀胱測壓是一項重要的動物實驗技術，在膀胱功能的檢測中有不可替代的作用,它可以準確地評估膀胱功能，是評估膀胱功能的金標準[12]。目前大鼠的膀胱測壓常用的有兩種，清醒狀態(tài)下測壓和麻醉狀態(tài)下測壓[13-15]，其各自的特點尚未完全明了。我們本次研究發(fā)現(xiàn)應用水合氯醛進行麻醉，大鼠在淺麻下膀胱可以自主收縮，但收縮力較清醒狀態(tài)弱，這和STRENG等[16]的研究結果相似，這可能是因為麻醉藥對大腦或膀胱神經的麻醉作用引起，也可能該麻藥對膀胱平滑肌本身也有作用。相對于淺麻醉，清醒狀態(tài)下膀胱有更好的排空能力，排尿間隔也更長，這可能是因為麻醉藥可以減弱膀胱排尿時的逼尿肌收縮力，導致大鼠的膀胱排空能力下降，結果大鼠每次排尿后膀胱的殘余尿量增加，而膀胱的最大容量沒有增加，導致膀胱的功能容量減小，排尿間隔就減小了。

本研究發(fā)現(xiàn)在淺麻醉和清醒狀態(tài)雄性大鼠的基礎膀胱壓和膀胱順應性差別沒有統(tǒng)計學意義，可能淺麻醉狀態(tài)下麻醉藥對膀胱的基礎壓及順應性沒有影響。但是我們發(fā)現(xiàn)在深麻狀態(tài)下大鼠的膀胱順應性較淺麻及清醒狀態(tài)是下降的，這可能和我們測量深麻醉狀態(tài)時沒有在充盈膀胱前排空膀胱有關，但也有可能在深麻醉狀態(tài)下大鼠的膀胱順應性會降低，具體原因有待將來進一步研究。

本研究顯示清醒測壓是可行的，大鼠性格較溫順，清醒狀態(tài)下造瘺后的大鼠可以配合實驗者完成膀胱測壓。雖然大鼠清醒時的活動及緊張會影響膀胱測壓結果，但當大鼠在限制性鼠籠待30 min以后，大鼠就會平靜下來，這是可以排除這些干擾的。結果也表明恥骨上造瘺測壓法是一種很好的大鼠膀胱測壓法，應用這種方法無論雌鼠或者雄鼠均可用進行膀胱測壓，如果應用尿道插管測膀胱壓，因雄性大鼠尿道長而曲折是很難進行的。本研究還顯示在淺麻狀態(tài)下大鼠有意識，可以自行排尿，雖然大鼠膀胱收縮力及排尿功能會部分減弱，但依然可以反映大鼠的膀胱功能。雖然淺麻醉狀態(tài)對大鼠膀胱功能有一定的影響，但大鼠在淺麻下容易管理，可以經尿道插管，也可以經肛門插管測腹壓[17]，淺麻醉行膀胱測壓有它的優(yōu)勢和可行性。對于一些特殊要求的膀胱測壓實驗，首選麻醉狀態(tài)下膀胱測壓，如研究活體大鼠的膀胱失神經支配的膀胱功能檢測[18]。

清醒狀態(tài)膀胱測壓和麻醉狀態(tài)膀胱測壓各有利弊，清醒測壓可以排除麻醉藥物的干擾，使測壓結果更貼近大鼠膀胱功能的生理狀態(tài)，但大鼠清醒狀態(tài)較難操控。麻醉狀態(tài)測壓大鼠容易操控，但測壓結果可能受到麻醉藥物的一定影響。清醒狀態(tài)下大鼠膀胱測壓一般在判斷制作的下尿路功能障礙大鼠模型膀胱功能評估時應用，這樣可以更貼近大鼠膀胱病理生理狀態(tài)，更容易確認膀胱功能障礙的存在與否。例如我們制作膀胱出口梗阻(bladder outlet obstruction,BOO)大鼠模型中，檢測大鼠膀胱是否已經被梗阻，在制作膀胱活動過度癥(overactive bladder,OAB)OAB模型中檢測大鼠膀胱是否存在逼尿肌過度活動及排尿間隔縮短。這些實驗需要在大鼠身上同時做的操作較少，不需要對大鼠進行嚴格的控制。但對于需要嚴格控制的復雜大鼠實驗，同時又要進行大鼠的膀胱測壓，淺麻醉下大鼠膀胱測壓就比較方便，例如實驗需要同時測腹壓，需要同時進行藥物靜脈注入，需要同時進行手術操作或進行上尿路的壓力檢測等等。

清醒測壓時大鼠在自由活動中可能會出現(xiàn)測壓連接管的脫落及扭轉，我們的經驗是應用較小的限制性鼠籠，不少文獻里說應用代謝籠，但其體積太大，我們應用的是直徑27 cm×16 cm ×13 cm的微型鼠籠加上一個7 cm高的金屬網格蓋子，效果挺好，連接管很少脫落，另外我們采用分段連接，即在鼠籠上方設置銜接口，可以隨時拆卸，這樣就可以隨時在籠外卸下抽取殘余尿，也避免了直接接觸動物，另外就是鼠籠中的銜接管盡量軟一些，這樣可以避免扭轉產生的管道堵塞，如果扭轉過度可以通過籠外的銜接口調整扭轉。調零：我們以大鼠所在籠底為零點，因為大鼠平靜后喜歡趴在籠底，大鼠的恥骨聯(lián)合貼近籠底，一旦調零后接上大鼠膀胱測壓管，機器的零點不會隨大鼠的移動改變，除非管內有空氣，如果那樣我們要排凈空氣后重新調零。

實驗中我們雖然僅檢測了術后第1天大鼠的尿動結果，但我們觀察了雄性大鼠長期帶膀胱造瘺管的情況，因該管直徑較粗，長期帶管容易引起大鼠的前列腺炎及精囊炎，所以如要長期觀察大鼠的膀胱功能情況，我們建議應用直徑更細的管子PE50管[19-21]，這種造瘺管更細，即使長期放置也不容易造成泌尿生殖系統(tǒng)感染，可以避免膀胱及生殖系統(tǒng)炎癥對膀胱測壓的影響。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)淺麻醉和清醒狀態(tài)的尿動力學部分參數(shù)指標是有差異的，淺麻醉狀態(tài)對膀胱的收縮能力有一定負面影響。我們應該根據(jù)實驗要求合理選擇大鼠的尿流動力學檢測方法。