青海省2016—2017年人腸道病毒A組71型基因特征

范麗霞 王衛(wèi)軍 巴卓瑪 趙生倉(cāng) 李崇亥 姜雙應(yīng) 嚴(yán)冬梅 冀天嬌

810007西寧,青海省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生檢驗(yàn)檢測(cè)中心(范麗霞、王衛(wèi)軍、巴卓瑪、趙生倉(cāng)、李崇亥、姜雙應(yīng));102206北京,中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(嚴(yán)冬梅、冀天嬌)

手 足 口 病 (hand， foot and mouth disease，HFMD)是由腸道病毒(human enterovirus，HEV)引起的傳染病，其中以腸道病毒A組71型(human enterovirus group A type 71，EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16，CV-A16)感染最為多見。自1974年Schmidt等[1]首次報(bào)道以來(lái)，全世界很多國(guó)家和地區(qū)先后報(bào)道了EV-A71的感染和流行情況[2-3]。近10年的流行病學(xué)研究顯示，全球各地HFMD暴發(fā)流行主要是由EV-A71引起[4-9]。青海省從2008年開始，每年對(duì)EV-A71的流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)顯示2012、2013、2015和2017年以EV-A71為優(yōu)勢(shì)病毒株，實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中EV-A71所占的比例分別為93.71%、65.52%、40.81%和42.15%。本文對(duì)2016—2017年青海省HFMD的主要病原體EV-A71的基因特征進(jìn)行分析，加強(qiáng)對(duì)EV-A71的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，了解EV-A71的基因特征，對(duì)預(yù)防和控制EV-A71的暴發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 收集2016—2017年青海省三家哨點(diǎn)醫(yī)院的患者咽拭子標(biāo)本566份，和8個(gè)市(州)級(jí)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本585份。

1.2 核酸檢測(cè) 按照衛(wèi)生部發(fā)布的《HFMD標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案》[10]，采用江蘇碩世病毒核酸提取試劑盒對(duì)咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒RNA提取，提取步驟按說(shuō)明書操作進(jìn)行。采用江蘇碩世rRT-PCR分型試劑盒對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行EV-A71、CV-A16和其他HEV檢測(cè)。

1.3 病毒分離 對(duì)核酸檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本采用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(human rhabdomyosarcoma，RD)細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，RD細(xì)胞由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家脊髓灰質(zhì)炎實(shí)驗(yàn)室提供。每1份標(biāo)本接種2支RD細(xì)胞，每支接種0.2 ml的標(biāo)本懸液，置36℃培養(yǎng)7 d。每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)并進(jìn)行記錄。每份標(biāo)本在RD細(xì)胞上至少傳兩代，出現(xiàn)腸道病毒特異的CPE后，保存在—20℃條件下待用。

1.4 EV-A71全長(zhǎng)VP1編碼區(qū)擴(kuò)增 用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，USA)提取病毒核酸。使用PrimeScriptTM One Step RTPCR Kit Ver.2(TaKaRa，大連)試劑盒對(duì)分離的EV-A71毒株全長(zhǎng)VP1編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[11]。

1.5 核苷酸序列測(cè)定 擴(kuò)增后的陽(yáng)性產(chǎn)物使用QIA-quickPCR purification kit(Qiagen，USA)試劑盒純化，然后分別使用上下游引物，按Big DyeTM Terminator V3.0 CycleSequencing Ready reaction(Applied Biosystems，USA)試劑盒中的標(biāo)記反應(yīng)條件進(jìn)行雙向標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠G-50(Pharmacia，Sweden)純化后，于 ABI 3500型序列測(cè)定分析儀上(Applied Biosystems，Japan)自動(dòng)測(cè)序和分析。

1.6 生物信息學(xué)分析 使用序列的校對(duì)和整理軟件Sequencher 5.0進(jìn)行序列圖譜整理，使用分子進(jìn)化遺傳分析(Molecular Evolution Genetics Analysis，MEGA)6.0軟件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的ClustalW 軟件包進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接法(Neighborjoining，NJ)構(gòu)建基于EV-A71毒株VP1編碼區(qū)的親緣關(guān)系樹。

2 結(jié)果

2.1 EV核酸檢測(cè) 2016—2017年青海省各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室及監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院共采集HFMD病例標(biāo)本1 446份，病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性 984份，總陽(yáng)性率為68.05%。

2.2 病毒分離與陽(yáng)性分離物的RT-PCR鑒定984份標(biāo)本在RD細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離，經(jīng)觀察出現(xiàn)典型腸道病毒CPE的有164株病毒，經(jīng)rRT-PCR腸道病毒定型，114株鑒定為EV-A71。

2.3 用于研究的病毒 114份EV-A71的分離物分別分離自114例HFMD病例。相關(guān)病例年齡≤13歲，男性60例，女性54例，性別比1.11∶1。2016年分離15株，2017年分離99株，分別來(lái)自青海省西寧市(68株)、海東市(44株)和海北州(2株)。

2.4 EV-A71分離株VP1編碼區(qū)核苷酸序列親緣進(jìn)化樹分析 114株青海省EV-A71分離株的VP1區(qū)核苷酸序列的長(zhǎng)度都是891個(gè)核苷酸，編碼297個(gè)氨基酸。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載54個(gè)各基因型及基因亞型(A～G，C1～C5)VP1區(qū)核苷酸參考序列，分別包含來(lái)自歐洲、亞洲、美洲和澳洲1970—2013年的代表株，其中C4代表株主要來(lái)自于中國(guó)，與114株青海省EV-A71分離株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析。2016—2017年，EV-A71毒株VP1編碼區(qū)核苷酸序列與C4基因亞型代表株具有最高同源性，為89.8% ～96.7%。C4基因亞型又分為C4a和C4b分支，本研究毒株與C4a(我國(guó)本土代表序列)和C4b分支核苷酸序列同源性分別為94.4%～96.7%和89.8%～92.7%。本研究毒株相互間的核苷酸序列同源性為91.5% ～100%，氨基酸序列同源性為9 8.3% ～1 0 0%。其中，2 0 1 6年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為2.3%和0.4%；2 0 1 7年毒株間核苷酸和氨基酸序列平均差異分別為3.4%和0.8%；2 0 1 6與2 0 1 7年毒株，核苷酸和氨基酸序列平均差異為3.6%和0.7%。

圖1 基于VP1編碼區(qū)(891bp)構(gòu)建青海2016—2017年分離株與其它EV-A71代表毒株的親緣性進(jìn)化樹Note:green dots represent EV-A71 strains of 2016，red dots represent EV-A71 strains of 2017Fig.1 Phylogenetic tree of EV-A71 isolates was constructed based on the VP1 coding region(891bp)in Qinghai province from 2016 to 2017)

2016—2017年青海省流行的EV-A71可以被劃分為2個(gè)進(jìn)化分支，即lineage1和lineage2，分別包含100株和14株EV-A71。lineage1與lineage2兩組間的核苷酸與氨基酸差異分別為6.95%和1.19%。其中 lineage1包含絕大多數(shù)(13/101，87.12%)的2017的 EV-A71毒株和幾乎全部的2016年EV-A71毒株，分布于西寧市和海東市，是本省流行優(yōu)勢(shì)分支。而lineage2僅有1株分離自2016年的EV-A71毒株，其余均為2017年毒株?？梢娗嗪Ｊ〉腅V-A71傳播鏈并不唯一，且在2017年進(jìn)化為較為明顯的2個(gè)傳播鏈(圖1)。

3 討論

HFMD是由多種腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國(guó)法定報(bào)告管理的丙類傳染病。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。由于腸道病毒傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快等特點(diǎn)，HFMD常出現(xiàn)暴發(fā)或流行。開展HFMD流行特征及病原學(xué)監(jiān)測(cè)對(duì)于防控策略的制定具有重要意義。而HFMD分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)是其中的重要組成部分，也是HFMD監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)方面最重要的任務(wù)之一。

青海省2016—2017年分離到的114株EV-A71大部分來(lái)自人口相對(duì)密集的西寧市和海東市，經(jīng)核苷酸同源性和基因親緣性關(guān)系分析，證實(shí)全部屬于C4基因型中的C4a基因亞型，和全國(guó)的流行情況一致[5]。青海省2016—2017年114株EV-A71分屬2個(gè)不同分支，說(shuō)明引起青海HFMD流行的EV-A71傳播鏈并不唯一。同時(shí)，基于基因親緣性關(guān)系樹發(fā)現(xiàn)，青海省不同傳播鏈上的EV-A71，分別與近年來(lái)在中國(guó)其他省流行的C4a基因亞型EV-A71在基因親緣關(guān)系和流行時(shí)間關(guān)系上都很接近，說(shuō)明青海省EV-A71不是獨(dú)立進(jìn)化的，而是與中國(guó)其他省流行的EV-A71在共同進(jìn)化。

盡管HFMD的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)在青海省已經(jīng)開展，建立了青海省HFMD的EV-A71毒株庫(kù)和基因資源庫(kù)，積累了一定的EV-A71分子流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)，但是青海省EV-A71監(jiān)測(cè)系統(tǒng)還比較薄弱，偏遠(yuǎn)的玉樹州、果洛州報(bào)告病例少，未開展采樣和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，因而得到的數(shù)據(jù)還不全面，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)并擴(kuò)大監(jiān)測(cè)范圍，建立青海省完整的EV-A71分子流行病學(xué)基線數(shù)據(jù)，以全面了解并闡明青海省流行EV-A71的基因型和基因亞型的特征，更好的為青海省HFMD的監(jiān)測(cè)與防控提供實(shí)驗(yàn)室參考。

利益沖突 無(wú)