一步法熒光RT-PCR檢測(cè)腸道病毒EV71的研究

劉曉青

手足口病(Hand-foot-mouth Disease，HFMD)是一種由腸道病毒感染引起的急性傳染病，以嬰幼兒發(fā)病為主，主要癥狀是發(fā)燒和手足口三個(gè)主要部位出現(xiàn)丘疹樣的皮疹[1]。每年大概在4～8月是一個(gè)流行的高峰，多發(fā)于5歲以下兒童，尤其是3歲以下的兒童發(fā)生率最高。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，包括腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、柯薩奇病毒A組(Coxsackievirus A)4、5、9、10、16型等，其中腸道病毒毒EV7l型最為常見(jiàn)，占最高比例。腸道病毒EV71是人腸道病毒的一種，簡(jiǎn)稱為EV71，常引起兒童手足口病、病毒性咽峽炎，重癥患兒可出現(xiàn)為肺水腫、腦炎等，統(tǒng)稱為腸道病毒EV71感染疾病[2-3]。近年手足口感染腸道病毒EV71率呈上升趨勢(shì)，連續(xù)數(shù)年成為我國(guó)傳染病發(fā)病率最高的病種之一，重癥及死亡病例多由EV-A71所致，對(duì)我國(guó)兒童的健康造成嚴(yán)重危害，因此研發(fā)出一種高靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性的檢測(cè)方法，對(duì)手足口病防治與治療顯得尤為重要。

伴隨著分子技術(shù)的發(fā)展，采用熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)腸道病毒進(jìn)行診斷國(guó)內(nèi)外已有報(bào)導(dǎo)，該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確以及自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，適用于傳染性病毒的檢測(cè)[4-6]。腸道病毒71型是2008年以后發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒，該病毒現(xiàn)在感染引起的手足口病越來(lái)越多，比科薩奇A組16型的毒力要強(qiáng)得多，引起了大量的不太嚴(yán)重的普通病例，但是其中它引起的一些重癥的病例病情非常嚴(yán)重，并且導(dǎo)致了部分病例的死亡。由于EV71腸道病毒基因組的高度變異率，針對(duì)EV71病毒及其它腸道病毒基因組設(shè)計(jì)的引物及探針都具有一定的時(shí)效性，需要不斷更新。本實(shí)驗(yàn)對(duì)EV71病毒檢測(cè)方法的研究，為快速準(zhǔn)確診斷EV71腸道病毒奠定基礎(chǔ)[7]，及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)患者，有利于減少手足口病的重癥及死亡病例,保護(hù)我國(guó)兒童生命健康[8]。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象 EV71腸道病毒樣品，汕尾逸揮基金醫(yī)院2017年10月份收集的樣品；大腸桿菌DH5a實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑盒，Taq酶購(gòu)買于上海生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì) 在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索選擇國(guó)內(nèi)近3年流行EV71型腸道病毒基因序列，采用DNAstar軟件進(jìn)行clustalV方法比對(duì)，選擇EV71型腸道病毒型序列共同的保守區(qū)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針，得到引物和探針序列如表1。

表1 引物和探針系列及熒光標(biāo)記

1.2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的制備 ①熒光RT-PCR擴(kuò)增條件：42℃ 30 min,95℃ 2 min,1個(gè)循環(huán)；95℃ 25 s，60℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。②目的基因的純化及回收:PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下切取目的片段，用DNA純化回收試劑盒回收目的cDNA，回收后置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。③目的基因的克隆及鑒定:將回收的DNA片段連接到pMDl8-T載體上，再轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞DH5a中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆菌落到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行熒光定量PCR鑒定及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，最后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送到上海英維捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立 ①實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化:以陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板，選用不同的引物濃度、退火溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，不斷地優(yōu)化其反應(yīng)條件，得到最佳的RT-PCR反應(yīng)條件。②線性范圍評(píng)估及最低檢測(cè)拷貝數(shù)確定：以9×107,9×106,9×105,9×104,9×103,9×102,9×10 copies/μL的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定熒光定量PCR檢測(cè)線范圍及最低檢測(cè)限的拷貝數(shù)。③重復(fù)性試驗(yàn)：選取9×102copies/μL濃度梯度的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，每個(gè)稀釋濃度進(jìn)行10個(gè)重復(fù)檢測(cè)。根據(jù)每個(gè)稀釋濃度的Ct值計(jì)算變異系數(shù)，判定該檢測(cè)方法的重復(fù)性是否良好。④臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn):利用建立的EV71型熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)經(jīng)確診為EV71型病毒感染的15份RNA樣本和5份陰性RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPASS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理重復(fù)性Ct值變異系數(shù)，Ct值變異數(shù)cv≤5%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆和重組質(zhì)粒的鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，與pMDl8 克隆載體連接構(gòu)成建重組質(zhì)粒，用“1.2”中的引物和探針對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條大小約130 bp的DNA片段(DNA Marker DL2 000)，與連接前的PCR產(chǎn)物大小一致(圖1)。將經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性重組菌株送到上海英維捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與目的片段序列完全一致。

注：1，2，3表示EV71 PCR 擴(kuò)增的DNA片段

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

熒光定量PCR檢測(cè)線范圍及最低檢測(cè)限拷貝數(shù)的確定 以梯度倍釋的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在9×102～9×107copies/μL檢測(cè)范圍內(nèi)線性擬合度良好，相關(guān)系數(shù)R2值為0.98，斜率為-4.26，擴(kuò)增效率為94.56%，固確定熒光定量PCR檢測(cè)線范圍為9×102～9×107copies/μL，最低模板拷貝數(shù)為900 copies/μL。見(jiàn)表2。

表2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3 檢測(cè)限重復(fù)性

試驗(yàn)選取9×102copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板以優(yōu)化的反應(yīng)條件分別連續(xù)擴(kuò)增10次，經(jīng)方差分析，組內(nèi)與組間CV≤5%，重復(fù)性很好，最低檢測(cè)限為900 copies/μL (圖2)。用該建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)80份陽(yáng)性樣本和36份陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際診斷結(jié)果一致，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。

圖2 EVUN基因片段實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的檢測(cè)限試驗(yàn)

3 討論

手足口病主要致病血清型包括柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)A組4～7、9、10、16型和B組1～3、5型，?？刹《?Echovirus)的部分血清型和腸道病毒71型(Enterovirus A71，EV-A71)等，其中以CV-A16和EV-A71最為常見(jiàn)。EV71病毒可引起皰疹性咽峽炎，嚴(yán)重患者可引起神經(jīng)性系統(tǒng)損傷，比如說(shuō)包括腦干，特別是延髓的部位受損，還可能引起脊髓的損傷，病情繼續(xù)發(fā)展的話甚至?xí)鹕窠?jīng)源性的肺水腫；重癥及死亡病例多由EV-A71所致。近年部分地區(qū)CV-A6、CV-A10有增多趨勢(shì)。腸道病毒各型之間無(wú)交叉免疫力。手足口病是全球性疾病，我國(guó)各地全年均有發(fā)生，發(fā)病率為37.01/10萬(wàn)～205.06/10萬(wàn)，近年報(bào)告病死率在6.46/10萬(wàn)～51.00/10萬(wàn)之間。

腸道病毒之間具有一定的同源性，不利于各血清型的區(qū)別鑒定，因此本試驗(yàn)選取腸道病毒基因中的一段高度保守高特異的序列作為目的基因檢測(cè)片段，從而避免了漏檢及非特異檢測(cè)問(wèn)題[9]。熒光定量RT-PCR檢測(cè)根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料法，熒光探針?lè)ǔ颂禺愐锿?，還增加了特異性的熒光探針，從而提高了特異性和準(zhǔn)確度，更適合臨床和科研的需要[10-12]。

手足口病病原檢測(cè)試方法的研究，有利于手足口病患者及時(shí)診斷，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，是防治手足口病的關(guān)鍵[13-15]。一步法熒光PCR檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約生產(chǎn)成本，與常規(guī)的檢測(cè)方法相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)，可適用于手足口臨床快速診斷，為檢測(cè)手足口病病原的研究奠定基礎(chǔ)。