IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

葉 園 ， 童章隆 ， 張 寧 ， 殷偉麗 ， 王 琳 ， 李 妍

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Primary Hepatic Carcinoma, PHC)是我國常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有78萬新發(fā)病例，約74萬死亡病例,其中我國約占45%,在癌癥相關(guān)死亡率中僅次于肺癌，排名第二。且肝癌的發(fā)病率逐年增加，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后不良[1]。目前，原發(fā)性肝癌最有效的治療手段是手術(shù)，但因腫瘤大小、部位、患者肝功能情況及已發(fā)生轉(zhuǎn)移等多種原因，往往無法進(jìn)行手術(shù)治療，只能選擇介入治療、放療、化療或綜合治療，但上述方法往往治療效果欠佳，預(yù)后差，大多數(shù)國家原發(fā)性肝癌5年生存率僅為3%～5%[2-3]。 因此，找尋更為有效的肝癌治療藥物或方法，提高肝癌患者的生存率，一直是肝癌治療研究的重要方向。研究表明，約有70%～90% 的原發(fā)性肝癌為肝細(xì)胞性肝癌[4]，人肝癌細(xì)胞HepG2 的組織來源為成肝細(xì)胞瘤，因此HepG2為國內(nèi)外進(jìn)行肝癌活性研究的經(jīng)典細(xì)胞模型。

IL-10是一種多細(xì)胞源、多效性的細(xì)胞免疫抑制因子。本課題組前期研究已證實(shí)IL-10對HepG2細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，本試驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡水平的影響，以期進(jìn)一步深入研究其促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長增殖的具體分子機(jī)制及找尋治療原發(fā)性肝癌新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人肝癌HepG2細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室朱文赫老師惠贈。

1.2 主要試劑 IL-10，購自美國PeproTech公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，由美國Hyclone公司生產(chǎn)；胎牛血清，購自世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；姬姆薩染液，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱，購自北京東方安若生化科技有限公司； 超凈臺，由蘇州凈化儀器廠生產(chǎn)；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品；MuseTM細(xì)胞分析儀，購自德國默克—密理博生物科技有限公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 取出于-80 ℃凍存的HepG2細(xì)胞，迅速放入37 ℃的水浴鍋中使其融化。細(xì)胞融化后移至超凈臺，將細(xì)胞懸液離心，加入含10%胎牛血清并含100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，吸管吹打混勻后，移入培養(yǎng)瓶中，置入體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶底部80%后即可進(jìn)行傳代，試驗(yàn)取用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.5 MuseTM細(xì)胞分析儀檢測HepG2細(xì)胞凋亡變化 取對數(shù)期HepG2細(xì)胞，接種于6孔板，放入培養(yǎng)箱中，37 ℃進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。24 h后添加含不同濃度IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h， IL-10的濃度分別為0(對照組)、10、20 ng/mL和 30 ng/mL。0.25%的胰酶消化，用完全培養(yǎng)液將每組細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，分別在1.5 mL離心管中每管加入100 μL細(xì)胞及100 μL MuseTMAnnexin V 試劑，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。后用MuseTM細(xì)胞分析儀檢測。

1.6 Hoechest33258染色檢測HepG2細(xì)胞凋亡水平 將培養(yǎng)的對數(shù)期HepG2細(xì)胞胰酶消化后，制備成細(xì)胞混懸液，常規(guī)接種于24孔板。培養(yǎng)24 h后，添加含不同濃度IL-10的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，給予4%多聚甲醛固定10 min后再用PBS沖洗兩遍。各組加入Hoechest33258染液避光染色5 min，再次PBS沖洗，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，并計(jì)算每50個細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，每種濃度計(jì)數(shù)4組，每組至少重復(fù)計(jì)數(shù)3次以上。

1.7 姬姆薩染色觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)變化 各組HepG2細(xì)胞常規(guī)接種于24孔板，加藥培養(yǎng)24 h后，棄上清，PBS 洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS再洗2 次，按照試劑盒說明書進(jìn)行姬姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。計(jì)算每50個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，每種濃度計(jì)數(shù)4組，每組至少重復(fù)計(jì)數(shù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 MuseTM細(xì)胞分析儀檢測HepG2細(xì)胞凋亡率 如圖1所示，與對照組相比， 10，20 ng/mL和30 ng/mL IL-10處理細(xì)胞24 h后，均可引起HepG2早期凋亡細(xì)胞數(shù)和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞存活率增加，且20 ng/mL和30 ng/ml IL-10作用更為明顯。IL-10抑制細(xì)胞凋亡的作用具有劑量相關(guān)性，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞總凋亡數(shù)逐漸減少。

圖1MuseTM細(xì)胞分析儀檢測IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

2.2 Hoechest 33258染色結(jié)果 Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料。如中插彩版圖2及圖3所示，與對照組相比，IL-10組HepG2細(xì)胞Hoechst 33258染色陽性細(xì)胞數(shù)均減少，染色質(zhì)凝集(亮藍(lán)色熒光) 、碎片化和邊緣化等典型凋亡細(xì)胞形態(tài)隨藥物濃度增加而緩解，與MuseTM細(xì)胞分析儀檢測不同濃度給藥組HepG2 細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。

圖3 不同濃度IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)目的影響

注：與對照組(0劑量組)比較 ； *：P<0.05

2.3 姬姆薩染色觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)變化 正常細(xì)胞的細(xì)胞核可被姬姆薩染液染為淡紫色均一狀，而凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)固縮，呈紫藍(lán)色深染。如中插彩版圖4所示，在倒置顯微鏡下可見，正常細(xì)胞呈不規(guī)則狀，胞質(zhì)均勻。與對照組相比，隨著IL-10濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目明顯增加，細(xì)胞間隙變小，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯降低。

圖5 不同濃度IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)目的影響

注：與對照組(0劑量組)比較 ； *：P<0.05

3 討論

細(xì)胞因子是指來自腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，可通過多種方式參與腫瘤的演進(jìn)及轉(zhuǎn)歸過程，發(fā)揮著協(xié)同或者拮抗效應(yīng)[5]。IL-10作為一種多效性的生物因子，不僅具有免疫抑制作用，還具有免疫刺激的作用，但其主要的生物學(xué)活性為免疫抑制作用。IL-10可通過多種方式發(fā)揮免疫抑制功能，如通過抑制Th1細(xì)胞增殖及IFN-γ等細(xì)胞因子的合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在機(jī)體抗炎及腫瘤免疫逃逸中起重要作用，促使腫瘤發(fā)生發(fā)展[6]。

有研究表明，在抗HBX抗體陽性的慢性乙型肝炎(Hepatitis B Virus，HBV)、肝硬化及原發(fā)性肝癌患者外周血中IL-10水平明顯升高，其中重度慢性乙型肝炎患者血清中IL-10水平與慢性乙型肝炎病毒攜帶者和健康人相比均顯著升高[7-9]，提示IL-10 與肝癌的發(fā)展存在一定的關(guān)系，但具體機(jī)制尚不明確。且IL-10在多種腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)。馬旭[10]等研究證實(shí)，通過下調(diào)IL-10的水平可達(dá)到抗小鼠宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。梁華剛[11-12]等研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌患者的外周血中，IL-10的水平隨腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移程度的增高而升高，在肺癌晚期患者的外周血中可檢測到CD4+、CD5+與IL-10呈負(fù)相關(guān)，與IL-10的免疫抑制作用相一致。我們通過前期試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，一定濃度的IL-10能夠明顯促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，且存在劑量依賴關(guān)系，但其機(jī)制尚不明確。

正常情況下，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡處于一種平衡狀態(tài)。研究表明，腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖有關(guān)，而且與細(xì)胞的抗凋亡作用也密切相關(guān)。肝細(xì)胞癌的發(fā)生是一個多基因參與、多步驟和多階段的復(fù)雜過程，其主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失衡[13]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的自殺現(xiàn)象，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)意義，目前多種藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)而抑制腫瘤生長增殖。為了進(jìn)一步確定IL-10是否對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和增殖具有雙重調(diào)節(jié)作用，我們在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探尋了IL-10對HepG2細(xì)胞凋亡水平的影響。

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，IL-10可抑制細(xì)胞凋亡，且隨著藥物濃度增大，細(xì)胞凋亡率降低，活細(xì)胞數(shù)增加；Hoechest33258和姬姆薩染色均觀察到，與對照組相比，加藥組凋亡細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞總數(shù)增多，細(xì)胞狀態(tài)更好。提示IL-10促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。接下來課題組將進(jìn)一步研究IL-10抑制細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，以期為尋找肝癌的特異治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。