重組水蛭素的抗血栓形成作用及其機制*

曹文理， 李 菁

(1. 武警后勤學院附屬醫(yī)院呼吸和重癥醫(yī)學科， 2. 武警后勤學院附屬醫(yī)院預(yù)防保健科， 天津 300162)

目前公認的血栓形成條件是由Vichow提出的三個條件：即血管內(nèi)皮細胞損傷、血流狀態(tài)的改變以及血液凝固性的增加。冷暴露環(huán)境下，配合使用血管內(nèi)皮細胞損傷藥物更有助于血栓的形成[1]。中藥在臨床上具有治療血栓形成的明確作用，具有增強免疫、抗衰老、抗突變、抗凝血功能[2-3]。活血化瘀中藥水蛭分泌的唾液中含有一種由65個氨基酸殘基組成的酸性多肽，即水蛭素，這是一種高度特異的凝血酶抑制劑，具有治療急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、肝素相關(guān)性血小板減少癥，預(yù)防深靜脈血栓形成的作用，也可用于血液透析過程中的抗凝。目前，基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得重組藥物的大量生產(chǎn)成為可能。用基因工程技術(shù)合成的重組水蛭素已成為防治各種血栓性疾病的有效藥物。本研究選取在冷暴露環(huán)境下腹腔注射角叉菜膠誘發(fā)的小鼠尾靜脈血栓形成模型，研究重組水蛭素抗角叉菜膠引起的尾靜脈血栓形成作用并分析其分子機制，為重組水蛭素廣泛用于臨床提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組水蛭素(10 mg/支，含80 mg甘露醇，重慶富進生物醫(yī)藥有限公司)；阿司匹林腸溶片(濟南永寧制藥股份有限公司)；Ⅰ型角叉菜膠(carrageenan type Ⅰ，Sigma，美國)；凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血激酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)測定試劑盒(北京世帝科學儀器公司)；組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑(type-1 plasminogen activator inhibitor，PAI-1)含量測定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)；6-酮-前列腺素F1α (6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α)、血栓惡烷B2 (thromboxane B2，TXB2) 放射免疫分析試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)；Flex Station3酶標儀(Molecular Devices，美國)；KS604721型放射免疫儀(北京科思佳科技有限責任公司)。阿司匹林溶液的配制：取阿司匹林腸溶片1片，加相應(yīng)體積的雙蒸水，配制成2.5 mg/ml的溶液，4℃保存。

1.2 實驗動物分組及給藥方法

SPF級雄性昆明小鼠60只，體重(18～22) g，由北京維通利華實驗動物中心提供。按體重將小鼠隨機分成6組(n=10)：正常組、模型組、阿司匹林組(腹腔注射25 mg/kg)組、重組水蛭素低、中、高劑量組分別腹腔注射重組水蛭素0.05、0.1、0.2 mg/kg。

1.3 尾靜脈血栓模型的制備

小鼠在(16～17)℃、相對濕度(30～50)%的環(huán)境下，于不加墊料的鐵籠中無束縛地適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。在腹腔注射角叉菜膠造模前24 h與0.5 h，阿司匹林組和重組水蛭素低、中、高劑量組分別腹腔注射阿司匹林25 mg/kg或重組水蛭素0.05、0.1、0.2 mg/kg一次，正常組和模型組小鼠分別腹腔注射等體積生理鹽水。然后除正常組外，各組小鼠分別腹腔注射2.5 mg/kg角叉菜膠造模(尾靜脈血栓造模成功的判定方法：尾部形成暗紅色血栓)[4-5]。造模開始后24 h，阿司匹林組和重組水蛭素低、中、高劑量組再腹腔注射給藥1次，正常組和模型組小鼠分別腹腔注射等體積生理鹽水。造模48 h后統(tǒng)計血栓長度(從鼠尾末端到形成暗紅色血栓前沿的長度)和成栓率[成栓率=(尾部形成暗紅色血栓的小鼠數(shù)量/本組小鼠樣本數(shù)量)×100%]。

1.4 PT, APTT及t-PA含量和PAI-1活性的檢測

小鼠眼內(nèi)眥取血0.3 ml(枸櫞酸鈉抗凝)，以4 000 r/min離心10 min，取上清液。嚴格按照PT、APTT試劑盒說明書要求進行檢測；按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作要求檢測t-PA和PAI-1含量。

1.5 TXB2和6-keto-PGF1a含量檢測

小鼠眼內(nèi)眥取血0.3 ml(消炎痛-EDTANa2抗凝)，以4 000 r/min 10 min后，取上清液。按放免分析試劑盒操作要求，分別測定血漿中6-keto-PGF1α及TXB2含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 重組水蛭素對角叉菜膠誘導小鼠血栓形成、凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間的影響

正常對照組小鼠尾部均未出現(xiàn)暗紅色血栓，模型組和各用藥組小鼠尾部均形成暗紅色血栓。重組水蛭素低、中、高劑量組血栓長度較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05，P<0.01)，提示腹腔注射重組水蛭素能明顯抑制小鼠尾部血栓的形成(表1)。

與正常對照組相比，模型組小鼠凝血酶原時間(PT)明顯縮短(P<0.01)，活化部分凝血激酶時間(APTT)無明顯變化。與模型組比較，腹腔注射重組水蛭素低、中、高劑量組小鼠血漿PT均明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而APTT無明顯變化，說明腹腔注射重組水蛭素能明顯抑制PT縮短，對APTT無明顯影響(表1)。與阿司匹林組比較，重組水蛭素低劑量組小鼠尾部血栓長度明顯增加 (P<0.05)，PT明顯縮短 (P<0.01)。

ConditionsThe length of thrombosis(mm)PT(s)APTT(s)Control 09.1±0.321.0±1.1Model61.7±8.0**7.4±0.2**21.3±1.6Aspirin46.9±7.5##8.7±0.4##21.1±1.3Hirudin low dose54.7±5.3#Δ8.0±0.4##ΔΔ20.7±1.2Hirudin middle dose52.4±4.1##8.6±0.2##21.0±1.0Hirudin high dose48.8±5.6##8.8±0.3##21.3±1.5

PT: Prothrombin time; APTT: Activated partial thromboplastin time

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsaspirin group

2.2 重組水蛭素對角叉菜膠誘導小鼠纖溶系統(tǒng)t-PA與PAI-1含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠t-PA濃度明顯下降(P<0.01)，PAI-1濃度明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，腹腔注射重組水蛭素低、中、高劑量組小鼠血漿t-PA濃度明顯升高(P<0.01)，PAI-1濃度明顯降低(P<0.01)，提示腹腔注射重組水蛭素能明顯抑制t-PA的降低和PAI-1的升高(表2)。與阿司匹林組比較，重組水蛭素低、中劑量組小鼠PAI-1水平明顯升高 (P<0.01)。

Conditionst-PA PAI-1 Control2.8±0.35.5±0.3Model1.5±0.2**9.0±0.3**Aspirin2.5±0.2##6.0±0.5##Hirudin low dose2.3±0.2##8.2±0.3##ΔΔHirudin middle dose2.5±0.1##7.4±0.2##ΔΔHirudin high dose2.6±0.2##6.1±0.3##

tPA: Tissue plasminogen activator; PAI-1: Type-1 plasminogen activator inhibitor

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;ΔΔP<0.01vsaspirin group

2.3 重組水蛭素對角叉菜膠誘導小鼠血漿6-keto-PGF1a與TXB2含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血漿6-keto-PGF1a含量明顯下降(P<0.01)，TXB2含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，腹腔注射重組水蛭素低、中、高劑量組小鼠血漿6-keto-PGF1a含量明顯升高(P<0.01)，TXB2含量明顯降低(P<0.01)，提示腹腔注射給予重組水蛭素能明顯抑制6-keto-PGF1a的降低和TXB2的升高(表3)。與阿司匹林組比較，重組水蛭素低、中劑量組6-keto-PGF1α水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；TXB2水平明顯升高 (P<0.01，P<0.05)。

Conditions6-keto-PGF1athromboxane B2Control151.2±10.1272.0±14.7Model105.5±8.1**363.1±18.7**Aspirin149.2±8.7##284.7±22.6##Hirudin low dose133.8±9.9##ΔΔ317.6±10.1##ΔΔHirudin middle dose137.5±11.3##Δ306.3±20.3##ΔHirudin high dose145.3±10.4##299.4±15.3##

TXB2: Thromboxane B2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsaspirin group

3 討論

機體冷暴露后有一個“冷致血管舒張反應(yīng)(cold-induced vasodilation, CIVD)”，即皮膚血管收縮一定時間后，動-靜脈吻合枝突然開放，使皮膚溫度回升。皮膚血管舒縮交替使皮膚溫度在一定范圍內(nèi)波動，皮膚仍能保持正常結(jié)構(gòu)和功能。如冷暴露超過機體的生理耐受限度，局部血管活動減弱甚至麻痹、血流減少或停滯，就會引起冷損傷，導致血流淤滯、血栓形成。血栓形成與血凝系統(tǒng)、血小板、纖溶系統(tǒng)密切相關(guān)。

本實驗要求實驗小鼠在(16～17) ℃、相對濕度(30～50)%的條件下，在不加墊料的鐵籠中無束縛地自由飲水，攝食。由角叉菜膠誘發(fā)的小鼠尾靜脈血栓形成不僅與角叉菜膠的濃度有關(guān)，與小鼠狀態(tài)、環(huán)境溫度、濕度均有非常密切的關(guān)系[6]。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，如溫、濕度控制不理想，即使將腹腔注射角叉菜膠的劑量增加到100 mg/kg，形成的尾靜脈血栓長度也只有20～30 mm。尾靜脈血栓形成是由角叉菜膠損傷血管內(nèi)皮的作用和冷環(huán)境因素協(xié)同作用的結(jié)果。小鼠在冷環(huán)境下，采用角叉菜膠腹腔注射，使血管內(nèi)皮細胞受損，從而誘發(fā)尾靜脈血細胞聚集、血流淤滯，進而形成暗紅色血栓。這種造模方法簡便實用，血栓形成的病理生理與臨床血栓形成的病理生理接近。血栓形成后可引起血管堵塞，導致組織器官缺血缺氧，誘發(fā)一系列的血管栓塞性疾病。

血栓形成和血液成分、凝血功能密切相關(guān)，活化部分凝血激酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)是反映凝血功能的比較重要的參考指標。APTT主要是反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的常用凝血指標，可以反映血液中內(nèi)源性凝血因子含量及其活性變化；PT主要是反映外源性凝血系統(tǒng)的常用凝血指標[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，角叉菜膠誘導小鼠尾部血栓形成后，血漿PT明顯縮短，而腹腔注射重組水蛭素能明顯延長血漿PT，對APTT無影響，提示重組水蛭素是通過外源性凝血系統(tǒng)改善血液的高凝狀態(tài)。

前列環(huán)素(PGI2)和血栓惡烷A2(TXA2)是血漿中的兩種不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)，6-keto-PGF1a和TXB2分別是其代謝生成的穩(wěn)定產(chǎn)物，檢測血漿中6-keto-PGF1a和TXB2含量能反映血漿中PGI2和TXA2的水平[8-9]。血小板粘附、聚集、釋放功能與血栓形成密切相關(guān)。TXA2由血小板產(chǎn)生并釋放入血，對血小板具有促進聚集作用，是血小板活化的標志物，對血管平滑肌有收縮作用。PGI2主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，中性粒細胞也可以合成，具有舒張血管功能，具有對抗血小板TXA2的作用。PGI2和TXA2兩者間保持著平衡，共同維持血液正常的凝血功能。實驗結(jié)果表明，角叉菜膠誘導小鼠血栓形成后，PGI2和TXA2 的平衡關(guān)系被打破，促進血小板聚集，誘導血栓形成，而腹腔注射重組水蛭素能顯著抑制TXA2的分泌，促進PGI2的分泌，起到了重建兩者平衡的作用。

纖溶系統(tǒng)調(diào)節(jié)纖溶活性的重要指標包括t-PA和PAI-1，兩者共同維持血液的流動性和血管的通暢狀態(tài)。組織型纖溶酶原激活物(t-PA)作為一種纖溶酶原生理性激活劑，在血栓纖溶過程中起到關(guān)鍵性的啟動作用。纖溶酶原主要由內(nèi)皮細胞和肝臟產(chǎn)生，由t-PA激活轉(zhuǎn)變成纖溶酶才具有溶解血栓的功能。PAI-1可以特異性結(jié)合t-PA，阻止t-PA激活纖溶酶原。兩者動態(tài)平衡的破壞可導致血管內(nèi)局部纖維蛋白分解速度降低，引起纖維蛋白沉積，導致血管內(nèi)血栓形成[4]。本實驗結(jié)果顯示，角叉菜膠促進血管內(nèi)膜損傷，導致局部血栓形成，t-PA激活纖溶酶原發(fā)揮纖維蛋白溶解作用。而血管內(nèi)皮細胞損傷和血小板活化后可釋放大量的PAI-1，其可與t-PA以1:1的比例結(jié)合使t-PA滅活，消耗大量的t-PA，降低纖溶活性，使血液處于高凝狀態(tài)，容易導致血栓形成。腹腔注射重組水蛭素能改善血管內(nèi)皮細胞損傷，抑制PAI-1的釋放，同時促進t-PA釋放，增強了纖溶功能，減少了血栓形成。

實驗結(jié)果表明，腹腔注射重組水蛭素具有劑量依賴性的抗血栓作用，可以延長PT，增加tPA的釋放，同時抑制PAI-1的釋放，且具有內(nèi)皮保護作用。重組水蛭素高劑量組與臨床常用藥阿司匹林沒有顯著性差異，說明重組水蛭素具有明確的臨床應(yīng)用價值。