組織工程皮膚種子細胞的研究進展

張廣靜 王正想 馮世軍

[摘要]組織工程皮膚的研究近年來發(fā)展迅速，其基本原理是，取正常皮膚組織通過體外培養(yǎng)足夠的細胞數(shù)量，將一定量的細胞接種到可降解的支架材料上分化成為具有一定形態(tài)和功能的皮膚模型。組織工程皮膚主要包括表皮替代物、真皮替代物及包含真表皮的全層皮膚替代物。全層皮膚模型主要包括三個方面，即種子細胞、可降解的真皮支架材料和體外培養(yǎng)的組織工程皮膚。但是燒傷造成的大面積皮膚缺損組織創(chuàng)傷、先天性巨痣等疾病導致皮膚壞死是一個重要的臨床問題，由于自體皮膚供皮部位缺乏迫切需要體外皮膚模型解決這些疑難問題。組織工程皮膚的重要部分之一是種子細胞，現(xiàn)就其相關研究進展進行綜述。

[關鍵詞]組織工程；皮膚；種子細胞；綜述

[中圖分類號] R318 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）7（a）-0028-04

[Abstract]Study on skin tissue engineering has developed rapidly in recent years，the basic principle is that of normal skin tissue in vitro by sufficient cell numbers，a certain amount of cells were seeded into scaffolds of biodegradable as skin model has certain morphological and functional differentiation.Tissue engineered skin substitutes contain epidermis substitutes，dermis substitutes，and full skin substitutes.The full layer skin model consists of three main aspects：seed cells，biodegradable dermis scaffolds and tissue engineered skin in vitro.However，skin necrosis caused by burns，such as large skin defects，tissue trauma，congenital giant nevus and other diseases，is an important clinical problem.Due to the lack of skin donor site，the external skin model is urgently needed to solve these difficult problems.One of the most important parts of tissue engineered skin is the seed cells，and the progress of their related research is reviewed.

[Key words]Tissue engineering；Skin；Seed cells；Review

如何尋找確實而可靠的方法替代動物實驗，在許多研究領域已顯得日益重要，特別是在皮膚研究方面，動物實驗替代方法的開發(fā)對于更好地認識皮膚生理，評價各種化妝品安全性、有效性等具有非常重要的意義。組織工程皮膚的問世，使有關動物的皮膚替代實驗成為可能。組織工程皮膚的基本原理是，通過獲得自體或異體的極少量組織，在實驗室中經(jīng)過滅菌、消化、分離、培養(yǎng)，在獲得足夠的細胞數(shù)量時，將其重組成具有一定形態(tài)和功能的組織器官。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)和組織構(gòu)建技術(shù)的提高，可以根據(jù)不同的需要，構(gòu)建單純的表皮、真皮，或同時含有表皮和真皮的全層皮膚。近年來，組織工程皮膚研究取得了可喜的成果，相繼有產(chǎn)品上市，這使得組織工程皮膚的應用不僅僅局限于治療，而開始應用于其他領域，如化妝品安全性檢測等，為皮膚檢測模型代替動物進行皮膚試驗奠定了基礎。種子細胞是組織工程皮膚的重要部分，現(xiàn)就其相關研究進行綜述。

1表皮細胞

1.1表皮細胞來源

表皮細胞來源于胚胎外胚層。角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）是表皮的主要組成細胞，屬于終末分化細胞，隨著傳代次數(shù)的增加，其會出現(xiàn)老化，增殖能力也會逐漸下降。上皮角質(zhì)形成細胞的來源多數(shù)取新生兒包皮組織體外獲取，組織供應無法保持穩(wěn)定導致皮膚模型無法批量生產(chǎn)[1]。由于異體細胞可引起機體的排斥反應，因此如何短時間內(nèi)獲取大量的自體表皮細胞，對于急需覆蓋創(chuàng)面的大面積燒、創(chuàng)傷患者是丞待解決的問題之一。

1.2永生化的上皮角質(zhì)形成細胞HaCaT[人用生化表皮細胞（immortalized human epidermal cells）]

HaCaT不具有致瘤性并且保留了角質(zhì)形成細胞的分化特性，其增殖能力強，培養(yǎng)簡單，并且容易大規(guī)模培養(yǎng)[2-3]。目前對HaCaT細胞的研究越來越多，例如其分化的機制[4]。研究認為HaCaT細胞是經(jīng)人乳頭瘤病毒轉(zhuǎn)染誘導形成的細胞系，其可以增殖和分化成12～15個細胞層次的表皮結(jié)構(gòu)，非常接近正常皮膚的表皮，因此具有和與正常角質(zhì)形成細胞相似的生物學特性，并且其不具有致瘤性，也無侵襲性[5]，可以作為體外構(gòu)建組織工程皮膚的種子細胞[6]。目前已經(jīng)有學者利用HaCaT細胞構(gòu)建出組織工程皮膚[7-8]，研究其是否可以應用于創(chuàng)面修復[9]。

2成纖維細胞

成纖維細胞是皮膚真皮層中主要細胞，特別是胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)，其比普通成纖維細胞增殖能力更強，免疫原性更低，有研究其具有無限增殖能力接近細胞系的性能[10]。上皮角質(zhì)形成細胞加入成纖維細胞構(gòu)建皮膚模型時，細胞生長因子（bFGF）分泌增加，促進創(chuàng)面恢復的能力更強，目前成纖維細胞的應用非常廣泛。組織工程皮膚的構(gòu)建加入成纖維細胞更加接近正常的皮膚結(jié)構(gòu)。

3干細胞

干細胞是一類多潛能細胞，具有自我更新的特性和無限增殖能力，經(jīng)誘導后可以定向分化。干細胞來源表皮干細胞、間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞等均可作為構(gòu)建皮膚組織工程皮膚的種子細胞。

3.1表皮干細胞

表皮干細胞具有無限更新能力，并且經(jīng)誘導后可以分化形成表皮細胞。表皮干細胞位于表皮的基底層。表皮不斷的自我更新主要就是依賴于皮膚基底細胞層中的干細胞，但是基底層的細胞只有少量是干細胞[11]，其在基底層的位置也是不斷變化的[12]。P63、CD29雙標記法經(jīng)常被作為鑒定表皮干細胞的便捷的方法，其敏感性較低，但是特異性較高。表皮干細胞在維持皮膚新陳代謝中起重要作用。有學者研究認為表皮干細胞有分化為汗腺和毛囊等結(jié)構(gòu)的潛能[13]，而在上皮組織的修復過程中缺少表皮干細胞其修復程度將受到明顯的影響[14]。表皮干細胞實現(xiàn)皮膚自我更新主要通過產(chǎn)生出大量的擴增細胞[15]，表皮干細胞分化階段不同，其標志物也在不斷變化，表達α2β1，α3β1等整合素，黏附鄰近細胞。Sun等[16]利用毛乳頭細胞誘導毛囊隆突部培養(yǎng)的干細胞再生毛囊結(jié)構(gòu)為組織工程皮膚毛囊化更進一步提供理論研究。隨著各種研究的不斷深入，表皮干細胞可分化為毛囊、皮脂腺、汗腺等。作為組織工程皮膚的種子細胞之一的表皮干細胞，將來有可能解解決組織工程皮膚缺乏皮膚附屬器的難題，使組織工程皮膚能真正大量應用于臨床[17]。

3.2間充質(zhì)干細胞（MSCs）

MSCs來源于中胚層和外胚層，是免疫原性低的成體干細胞，也是干細胞家族的重要成員之一，是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的主要細胞成分之一，其對各類免疫細胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)MSCs可通過調(diào)節(jié)T細胞的活化和增殖來抑制免疫反應[18-19]，其可通過細胞間直接接觸[20-21]對T細胞進行調(diào)節(jié)，也可通過分泌可溶性因子來調(diào)節(jié)T細胞。由于其具有取材方便、培養(yǎng)容易、增殖力強、低免疫原性、表達穩(wěn)定的特點，因此MSCs在特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨等多種組織細胞。MSCs主要包括骨髓MSCs、人臍帶MSCs、脂肪MSCs、毛囊干細胞等。

3.2.1骨髓MSCs 在骨髓組織中含量最為豐富，來源于中胚層和外胚層。其為自體干細胞，取材方便，培養(yǎng)容易，增殖能力強，并且無排斥反應，外源基因轉(zhuǎn)染表達穩(wěn)定。其在適宜的微環(huán)境下可分化多種細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)星型膠質(zhì)細胞等[22-23]。在皮膚出現(xiàn)大面積嚴重損傷的修復過程中，在創(chuàng)傷較大創(chuàng)面難愈合的創(chuàng)面加入骨髓MSCs，可加速創(chuàng)面的愈合[24]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自體骨髓MSCs在一定條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥ぜ毎捌つw附屬器細胞[25]，還能促進新生血管形成，加速創(chuàng)面愈合。

3.2.2臍帶MSCs 起源于中胚層，其產(chǎn)生的微環(huán)境對造血干細胞的歸巢及增殖分化意義重大。其主要存在于臍帶沃頓膠和血管周圍組織中[26]。人臍帶MSCs能夠向心肌和骨骼肌方向分化，還可以向成骨細胞和軟骨細胞等方向分化，還具有支持造血干細胞的擴增。有研究表面組織來源不同的臍帶血MSCs的免疫表型特征卻非常相似[27]。由于人臍帶血MSCs不受倫理和道德約束，排斥反應小，由于臍帶胎盤的保護感染細菌和病毒風險很低，并且沒有形成畸胎瘤的風險。因此，人臍帶MSCs在血液病、老年癡呆、帕金森等疾病治療等方面提供新的治療方案。

3.2.3脂肪MSCs 在2001年由Eppley[28]離體培養(yǎng)得到，證實具有干細胞的功能，可以取材于不同部位的脂肪組織。其具有來源充足、易于在體外培養(yǎng)擴增、干細胞含量豐富、無致瘤性等優(yōu)點。脂肪MSCs在一定的誘導條件下可以向成骨細胞[29]、干細胞[30-32]、神經(jīng)細胞[33]、肌肉細胞[34]等定向分化?？杀磉_CD11a、CD13、CD14、CD29[35-37]，不表達CD40、CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ等生物學特性。因此，今后在自體脂肪移植及組織工程皮膚構(gòu)建等方面有很大的研究及應用價值。

4其他細胞

其中包括內(nèi)皮細胞、黑色素細胞等。Rehder等[38]在體外構(gòu)建的組織工程表皮中加入黑色素細胞，結(jié)構(gòu)所構(gòu)建出的皮膚模型在形態(tài)學上與非常接近正常皮膚，為研究皮膚光老化進一步奠定基礎。也有研究表明將汗腺干細胞移植到裸鼠背部全層皮膚缺損上，其創(chuàng)面血管化明顯，加速創(chuàng)面修復能力[39]。

5展望

構(gòu)建組織工程皮膚的目的是使其在形態(tài)上和功能上非常接近正常皮膚，除了具有表皮和真皮結(jié)構(gòu)還有皮膚附屬器的結(jié)構(gòu)，能快速血管化及神經(jīng)重建。雖然已經(jīng)有很多組織工程皮膚問世，但僅僅是表皮替代物或真皮替代物，缺乏皮膚附屬器，不具有真正的皮膚功能。近些年來隨著對干細胞的深入研究，合適的種子細胞是組織工程皮膚構(gòu)建成功的關鍵，但是如何提高種子細胞的安全性、增殖分化能力及降低免疫特性及干細胞特異性標記等問題，需要進一步深入研究。以后將會有越來越多功能完善的組織工程皮膚研究成功，為廣大創(chuàng)傷者帶來希望。

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（收稿日期：2018-02-11 本文編輯：崔建中）