鐵皮石斛愈傷組織穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立

許丁帆　李建科　劉艷軍　羅銳　白燕嬌　曹凌峰　丁鵬瑋　黃俊軒

摘 要：為了建立穩(wěn)定的鐵皮石斛愈傷組織培養(yǎng)體系，試驗(yàn)開展了鐵皮石斛愈傷組織最佳外植體類型、誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以及繼代培養(yǎng)基配方的篩選等研究。結(jié)果表明，采用鐵皮石斛莖段為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好；初步誘導(dǎo)出的愈傷組織在MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 NAA的培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)生長速度快、質(zhì)地硬、結(jié)構(gòu)松散的理想愈傷組織；經(jīng)過篩選的愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織可以長時(shí)間保持理想狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；培養(yǎng)基；愈傷組織；激素

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.016

Abstract： In order to establish a stable callus culture system of D. candidum， the optimal explant type， callus induction medium formula， and subculture medium formula were studied and screened. The results showed that using the stems of D. candidum as explants had the best callus induction effect； the medium MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2.4-D+0.2 mg·L-1 NAA could induce the ideal callus with fast growth rate， hard texture and loose structure； the subculture medium MS+0.5 mg·L-1 KT+1 mg·L-1 2，4-D could remain the inducted ideal callus above for a long time.

Key words： Dendrobium candidum； medium； callus； hormone

我國是中草藥生產(chǎn)的大國，近年來，由于土地資源的限制和環(huán)境變化，導(dǎo)致一些中草藥生產(chǎn)受到了嚴(yán)重影響，隨著人們對(duì)中草藥有效成分的認(rèn)識(shí)，越來越多的研究集中在中藥有效成分的提取和生產(chǎn)上，這也是中藥國際化的必然趨勢(shì)[1-3]。利用植物愈傷組織進(jìn)行次生代謝物的生產(chǎn)，在藥用植物上越來越多。近年來，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)離體生產(chǎn)藥用植物的有效成分逐漸受到重視[4-7]。采用愈傷組織進(jìn)行生物制藥的研究已經(jīng)成為藥用植物離體生產(chǎn)的主流，其主要優(yōu)勢(shì)有：第一，愈傷組織生長速度快，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的細(xì)胞，從而獲取更多的藥用成分；第二，愈傷組織容易誘導(dǎo)，而且易于體外控制，可以在離體條件下改變培養(yǎng)基成分，生產(chǎn)出更多的藥用成分；第三，愈傷組織的培養(yǎng)成本較低；第四，可以利用愈傷組織進(jìn)行離體誘變，選育產(chǎn)量高的細(xì)胞株系。目前，愈傷組織在次生代謝物生產(chǎn)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，在未來生物制藥領(lǐng)域必將發(fā)揮其重要作用。

本研究通過誘導(dǎo)鐵皮石斛外植體產(chǎn)生生長穩(wěn)定、組織形態(tài)理想的愈傷組織，目的是利用這類愈傷組織進(jìn)行一定的科學(xué)研究或利用愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)有效藥物成分，為生物制藥的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用鐵皮石斛組培苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)最佳外植體的篩選 本試驗(yàn)采用鐵皮石斛組培苗的不同組織部位作為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，篩選出愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的外植體類型。

剪取鐵皮石斛組培苗，在超凈臺(tái)中將葉片、莖段和根剪下，造成兩端都有傷口的外植體，其中葉片剪掉葉尖，莖段不帶腋芽，根剪掉根尖。將剪好的外植體接種到提前準(zhǔn)備的MS+2 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。將接種好的三角瓶放到組培室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強(qiáng)度1 000 lx。接種后每天觀察外植體傷口部位的變化和外植體的生長情況，60 d時(shí)記錄愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.2 不同激素對(duì)鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)的影響 根據(jù)1.2.1試驗(yàn)結(jié)果顯示，莖段誘導(dǎo)的愈傷組織最好，為進(jìn)一步獲得結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的理想愈傷組織類型，本試驗(yàn)采用含有不同激素的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織再次誘導(dǎo)，篩選出愈傷組織形態(tài)和生長速度最好的培養(yǎng)基配方。

取鐵皮石斛組培苗莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織，將其分割成直徑2～3 mm的小塊，分別接種到事先配制好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的BA、KT、NAA和2，4-D。培養(yǎng)條件與1.2.1相同。

1.2.3 不同激素對(duì)鐵皮石斛愈傷組織穩(wěn)定生長的影響 為了使1.2.2試驗(yàn)中獲得的結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬、生長快速的愈傷組織長時(shí)間保持原有狀態(tài)和繼代生長，本試驗(yàn)選用不同培養(yǎng)基，對(duì)愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，篩選出適宜鐵皮石斛愈傷組織穩(wěn)定生長的培養(yǎng)基。

選取1.2.2中誘導(dǎo)出的鐵皮石斛理想的愈傷組織類型，在超凈臺(tái)中分割成大小為3～5 mm直徑的小塊，接種到事先配制好的含有不同濃度KT、2，4-D和NAA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配制方法和培養(yǎng)條件與前面相同。經(jīng)過2～3次繼代培養(yǎng)，繼代過程中選擇理想的愈傷組織進(jìn)行繼代，每次繼代時(shí)間為30 d，統(tǒng)計(jì)每種培養(yǎng)基愈傷組織的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐵皮石斛外植體誘導(dǎo)愈傷組織的篩選

從表1 可以看出，采用葉片作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)率為0，說明鐵皮石斛葉片不能誘導(dǎo)出愈傷組織，這可能與葉片組織中含有分生組織少有關(guān)；采用莖段和根均能誘導(dǎo)出愈傷組織，說明這2種外植體含有一定量的分生組織，利于愈傷組織誘導(dǎo)，但從愈傷組織誘導(dǎo)率來看，莖段高于根，說明莖段中含有更多的分生組織；從愈傷組織顏色和生長速度來看，莖段傷口誘導(dǎo)出的愈傷組織生長較快，顏色為傳統(tǒng)的淡綠色，而從根誘導(dǎo)出的愈傷組織則生長緩慢，顏色為白色。由此可見，莖段作為鐵皮石斛愈傷組織初步誘導(dǎo)的外植體較為適合。

2.2 不同激素對(duì)鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，不同激素組合的培養(yǎng)基對(duì)于鐵皮石斛愈傷組織生長的影響較大，不僅影響其生長速度，還對(duì)愈傷組織質(zhì)地和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。具體來看，與2 mg·L-1 2，4-D組合時(shí)，相同濃度的KT較BA更能夠獲得生長速度快、質(zhì)地硬且結(jié)構(gòu)松散的愈傷組織，說明與BA相比，KT更適合作鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)用分裂素，但生長速度并不理想；在KT和2，4-D的基礎(chǔ)上，加入0.2 mg·L-1生長素NAA，即可使愈傷組織生長速度加快，其中當(dāng)KT為2 mg·L-1時(shí)，能同時(shí)獲得生長速度快且質(zhì)地和結(jié)構(gòu)理想的愈傷組織。由此可見，鐵皮石斛理想愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2 mg·L-1 KT+2 mg·L-1 2，4-D+0.2 mg·L-1 NAA。

2.3 不同激素對(duì)鐵皮石斛愈傷組織穩(wěn)定生長的影響

從表3可以看出，采用不同培養(yǎng)基獲得的鐵皮石斛愈傷組織的生長情況存在較大的差異，在KT+2，4-D激素組合基礎(chǔ)上，添加生長素NAA可使愈傷組織生長速度加快，但其質(zhì)地和結(jié)構(gòu)均不理想，說明鐵皮石斛愈傷組織穩(wěn)定培養(yǎng)基中不宜繼續(xù)添加NAA；在相同濃度的KT（1.0 mg·L-1）基礎(chǔ)上，2 mg·L-1 2，4-D較1 mg·L-1 2，4-D條件愈傷組織的生長速度快，但其結(jié)構(gòu)較松散，說明增加2，4-D的濃度會(huì)提高愈傷組織生長速度但降低其松散程度，為獲得質(zhì)地和結(jié)構(gòu)理想的鐵皮石斛愈傷組織，2，4-D的濃度以1 mg·L-1為宜，但其生長速度較慢；固定2，4-D的濃度（1 mg·L-1），0.5 mg·L-1 KT較1.0 mg·L-1 KT條件下愈傷組織生長速度快，說明降低KT的使用濃度可以緩解愈傷組織生長速度下降問題。由此可見，采用MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)可以保持鐵皮石斛愈傷組織類型不變，雖然生長速度較誘導(dǎo)時(shí)有所下降，但可以通過縮短繼代時(shí)間加以克服。

3 結(jié)論與討論

愈傷組織從結(jié)構(gòu)、質(zhì)地和生長速度可以分成不同類型，其質(zhì)地主要取決于組成愈傷組織的細(xì)胞在培養(yǎng)初期時(shí)的起源。由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞通過分裂形成的愈傷組織一般結(jié)構(gòu)緊密，這種愈傷組織在生長后期只有愈傷組織團(tuán)的表面幾層細(xì)胞生長活躍，而內(nèi)部多形成組織化，逐漸失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，沒有活細(xì)胞的功能；而由分散的多個(gè)細(xì)胞形成的愈傷組織就會(huì)結(jié)構(gòu)松散，這類細(xì)胞彼此分開，這類愈傷組織從里到外均由相同細(xì)胞組成，常被用于研究和應(yīng)用中[8-12]。

愈傷組織的特性由組成它的細(xì)胞類型決定，不同試驗(yàn)?zāi)康男枰T導(dǎo)不同類型的愈傷組織，用于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)或進(jìn)行細(xì)胞次生代謝物的生產(chǎn)的愈傷組織應(yīng)具備結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬且生長速度較快等特點(diǎn)，這類愈傷組織主要是由分裂能力較強(qiáng)、細(xì)胞質(zhì)濃度較大、細(xì)胞間聯(lián)系并不緊密的細(xì)胞組成[13]。因此，本試驗(yàn)將鐵皮石斛結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬且生長速度較快的愈傷組織類型作為理想的愈傷組織。

本試驗(yàn)通過對(duì)影響鐵皮石斛愈傷組織誘導(dǎo)過程中的因素進(jìn)行研究，獲得了一套誘導(dǎo)松散型、質(zhì)地硬且生長速度快的鐵皮石斛愈傷組織類型的誘導(dǎo)方法：采用莖段為外植體，將其接種到MS+2 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的初步誘導(dǎo)；將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+2 mg·L-1 KT+0.2 mg·L-1 NAA+2 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地硬且生長速度較快的愈傷組織類型；將這類愈傷組織接種到MS+0.5 mg·L-1 KT +1 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，愈傷組織可以長時(shí)間保持理想狀態(tài)。

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