牛樟芝三萜類(lèi)化合物的提取工藝及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展

吳昊，郭美娟，王紅，張巖，劉曉光，張?zhí)m天

（河北省食品檢驗(yàn)研究院河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050091）

牛樟芝（Antrodia camphorata）又名樟芝、牛樟菇、紅樟芝、樟窟內(nèi)菇，通常腐生于牛樟樹(shù)上百年的樹(shù)干空洞內(nèi)，而牛樟樹(shù)主要在海拔600 m～1 000 m以上地區(qū)分布，故牛樟芝是一種非常珍稀的藥用菌[1]。牛樟芝子實(shí)體的形態(tài)特征非常多樣，其子實(shí)體的表面多為紅棕色、淺棕色或淺黃棕色。研究表明牛樟芝具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及保肝等作用[2-7]，也可用于治療食物和藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和皮膚瘙癢等[8]，其主要活性成分有三萜類(lèi)化合物、多糖、馬來(lái)酸和琥珀酸的衍生物、脂肪酸、泛醌類(lèi)化合物等[9]，其中，三萜類(lèi)化合物是目前牛樟芝子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)最多的萜類(lèi)化學(xué)成分，被認(rèn)為是牛樟芝萃取物中苦味成分的主要來(lái)源。

目前專(zhuān)家學(xué)者從牛樟芝子實(shí)體及菌絲體中陸續(xù)分離得到的三萜類(lèi)化合物多達(dá)40余種，其中僅牛樟芝所特有的三萜類(lèi)化合物便有10多種[10-11]。牛樟芝三萜類(lèi)化合物在抗腫瘤活性調(diào)節(jié)中扮演著重要角色，其具有抑制肝癌細(xì)胞的增殖、毒殺老鼠血癌細(xì)胞活性、抗血清素活性、活化神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)能力等功能[12]。試驗(yàn)證實(shí)，從牛樟芝子實(shí)體中提取的麥角甾烷型三萜類(lèi)化合物對(duì)人類(lèi)肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞以及乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性均表現(xiàn)顯著，并且對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞有著明顯的協(xié)同毒害作用[13]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖糖尿病小鼠模型中，牛樟芝三萜類(lèi)化合物能夠減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口愈合[14]。此外，三萜類(lèi)化合物還對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性有著顯著的抑制作用，可以降低血壓，防止高血壓患者因血壓過(guò)高導(dǎo)致腦血管破裂而中風(fēng)[15]。

本文對(duì)牛樟芝三萜類(lèi)化合物的提取工藝及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為牛樟芝三萜類(lèi)藥食同源產(chǎn)品的深入研究以及開(kāi)發(fā)利用提供思路和理論參考。

1 牛樟芝三萜類(lèi)化合物的提取方法

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是根據(jù)牛樟芝子實(shí)體和菌絲體中的各組分在溶劑中的溶解性質(zhì)不同，選用對(duì)三萜類(lèi)化合物溶解能力強(qiáng)，對(duì)其它組分溶解能力弱的溶劑，從而將三萜類(lèi)化合物提取出來(lái)的方法。目前常用乙醇、甲醇或異丙醇溶液作為溶劑，對(duì)牛樟芝發(fā)酵液和菌絲體進(jìn)行室溫浸提、煎煮或加熱回流提取，從而獲得總?cè)铺崛∥铩?/p>

1.1.1 室溫浸提

作為較傳統(tǒng)的提取方法，當(dāng)前室溫浸提法仍是獲得牛樟芝總?cè)频闹饕に囀侄?。劉燕隔[16]在室溫（20℃左右）下采用醇提法來(lái)制備牛樟芝菌絲體中三萜類(lèi)化合物，將牛樟芝菌絲體粉末在75%乙醇、提取溫度80℃、分離純化時(shí)間1.5 h、料液比1∶40（g/mL）的條件下進(jìn)行分離純化，之后于4 000 r/min離心10 min，取上清液，便得到提取液。同時(shí)，諸多專(zhuān)家學(xué)者在優(yōu)化室溫浸提法提取工藝方面也展開(kāi)了相關(guān)研究。韓金龍[17]選取95%甲醇、乙醇和異丙醇3種較常用的提取試劑對(duì)牛樟芝中的總?cè)七M(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)乙醇的提取效果略高于甲醇，異丙醇的提取效果最差。黃紅雨等[18]將響應(yīng)面法應(yīng)用于對(duì)牛樟芝總?cè)铺崛」に嚨膬?yōu)化，并根據(jù)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)得出最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度78%、提取時(shí)間81min、料液比 1∶20（g/mL），在此條件下，牛樟芝總?cè)铺崛÷蕿?.26%。

1.1.2 熱回流循環(huán)提取

熱回流循環(huán)提取工藝是一種新型動(dòng)態(tài)提取濃縮工藝，集提取濃縮為一體，其使用的裝置是一套全封閉間歇循環(huán)動(dòng)態(tài)提取裝置。目前熱回流循環(huán)提取法大量使用于規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)中，具有生產(chǎn)方式簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟度高、提取量大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[19]。王宮等[1]采用正交設(shè)計(jì)法確定了牛樟芝總?cè)谱罴鸦亓魈崛」に嚍?倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，之后用氯仿溶解濾液，再用飽和NaHCO3溶液萃取4次，牛樟芝總?cè)铺崛÷蔬_(dá)到10.02%。

1.1.3 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法已在中草藥提取和成分鑒定中取得一定的成果，超聲波輔助提取三萜類(lèi)化合物具有提取率高、時(shí)間短、提取成分完全、污染少、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。王光磊等[20]采用L4（23）正交試驗(yàn)法確定超聲輔助提取法的最佳工藝條件為：樟芒與乙醇料液比1∶15（g/mL），在150 W功率下提取60 min。韓金龍[17]研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取牛樟芝總?cè)频淖罴压に嚍椋毫弦罕?1∶100（g/mL），提取劑 95%乙醇，提取溫度50℃，提取時(shí)間1 h，超聲功率為300 W。呂莎等[21]通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化得到牛樟芝總?cè)频淖罴烟崛」に嚍?∶20（g/mL）液料比用倍的90%乙醇超聲輔助提取2次，每次40 min，超聲功率400 W，在此工藝條件下，提取率可達(dá)11.87%。

1.1.4 微波輔助提取

作為一種新型提取方法，微波輔助提取法己在黃酮、皂苷、多糖、三萜等有效成分的提取中廣泛應(yīng)用。韓金龍[17]以95%的乙醇為提取溶劑，對(duì)比冷浸24 h，熱回流6 h，超聲1 h和微波10 min 4種不同方法，發(fā)現(xiàn)在較短的時(shí)間內(nèi)微波輔助提取法的提取效果最優(yōu)，并且以增加三萜提取量為目的確定了該法的最佳工藝為：萃取劑二氯甲烷、提取劑90%乙醇，料液比1∶51（g/mL），時(shí)間 9.5 min，溫度 65℃，功率600 W，在此工藝下三萜提取量可達(dá)到7.65 mg/g。但微波輔助提取法的處理量很小，從而限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的規(guī)?；瘧?yīng)用。

1.2 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是一種新型提取分離方法，在近常溫條件下便可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同極性、不同沸點(diǎn)化合物的提取分離，在提取分離過(guò)程中，原料的有效成分幾乎可以被全部保留，同時(shí)無(wú)有機(jī)溶劑殘留。該法操作簡(jiǎn)單并且節(jié)約能源，通過(guò)超臨界流體萃取法獲得的產(chǎn)物純度和提取率均較高。近幾年，該法發(fā)展較快，在萜類(lèi)物質(zhì)提取方面的應(yīng)用日漸增多，馬禮金等[22]曾用超臨界流體對(duì)紅芝及其孢子中的三萜類(lèi)化合物進(jìn)行提取。但超臨界提取所需設(shè)備價(jià)格昂貴，成本較高。

2 牛樟芝三萜類(lèi)化合物的檢測(cè)

牛樟芝三萜類(lèi)化合物的檢測(cè)分析方法現(xiàn)在已經(jīng)基本成熟，主要有重量法、比色法和色譜法。此外，通過(guò)充分利用新技術(shù)，專(zhuān)家學(xué)者還在不斷建立新型的快速檢測(cè)方法，如Rao等建立的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法，該方法能夠同時(shí)測(cè)定牛樟芝中10種三萜類(lèi)化合物成分，能夠成功實(shí)現(xiàn)對(duì)牛樟芝子實(shí)體和菌絲體中三萜類(lèi)化合物的定性和定量分析[23]。

2.1 牛樟芝總?cè)频臋z測(cè)

2.1.1 重量法

根據(jù)三萜類(lèi)化合物的極性，采用水和氯仿（或乙酸乙酯、正丁醇）對(duì)牛樟芝進(jìn)行分離萃取，有機(jī)相分離濃縮后得到的物質(zhì)即為總?cè)?，采用此法?duì)總?cè)七M(jìn)行測(cè)定即為重量法[24]。重量法較為簡(jiǎn)便，應(yīng)用較為廣泛，但是由該法所得總?cè)频募兌炔桓摺?/p>

2.1.2 比色法

牛樟芝中總?cè)频臋z測(cè)一般采用分光光度法，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性佳的優(yōu)點(diǎn)。目前應(yīng)用較為廣泛的比色法主要是香草醛-高氯酸法[25-26]，即利用三萜類(lèi)化合物在加熱條件下可與香草酸和高氯酸發(fā)生顯色反應(yīng)，將三萜類(lèi)化合物在550 nm下的吸光度按照齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液制作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算，可以確定牛樟芝中總?cè)频暮縖27]。此外，也有相關(guān)研究是依據(jù)熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液制作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定牛樟芝總?cè)坪縖18]。除了香草醛-高氯酸法，有研究采用硫酸乙醇顯色法來(lái)測(cè)定提取液中三萜類(lèi)化合物的含量，但樣品中的干擾物質(zhì)對(duì)這兩種方法都有較大影響。

2.2 牛樟芝三萜類(lèi)單體成分的檢測(cè)

目前用于牛樟芝三萜類(lèi)單體成分的分析檢測(cè)方法主要有光譜學(xué)、生物學(xué)及色譜學(xué)方法，其中，以色譜學(xué)方法應(yīng)用最為廣泛。用于牛樟芝三萜類(lèi)單體成分檢測(cè)的色譜法主要包括薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法及其與質(zhì)譜聯(lián)用等方法。

2.2.1 薄層色譜法

薄層色譜法屬于吸附色譜法，該法兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，是一種微量、快速、簡(jiǎn)單、分離能力強(qiáng)的方法，近年來(lái)已被成功應(yīng)用于定量分析三萜類(lèi)單體成分。但是薄層色譜法在三萜類(lèi)化合物的測(cè)定方面仍存在一定的缺陷，如該法不適用于總?cè)坪糠治?，同時(shí)其分析準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和選擇性較差，因此一般只能采用該法做半定量或限度試驗(yàn)。張寅等[28]運(yùn)用薄層色譜-分光光度法排除脂肪等物質(zhì)的干擾對(duì)牛樟芝菌粉中的總?cè)坪窟M(jìn)行了檢測(cè)。韓金龍[17]將牛樟芝總?cè)拼痔嵛锝?jīng)分離純化后進(jìn)行薄層色譜分析，并以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到的薄層色譜與標(biāo)準(zhǔn)品的位置和顏色均接近。Chen等[29]利用薄層色譜對(duì)不同生長(zhǎng)階段的紅色和白色牛樟芝中的三萜類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同菌種、不同生長(zhǎng)階段其三萜類(lèi)物質(zhì)存在差異。

2.2.2 氣相色譜法

氣相色譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但該法要求化合物具有一定的揮發(fā)性，而大多三萜類(lèi)物質(zhì)的揮發(fā)性較差，因此采用該法進(jìn)行定量分析時(shí)往往需要將三萜類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行衍生化處理后才能進(jìn)行檢測(cè)，這使得該法的應(yīng)用在一定程度上受到了限制。

2.2.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法常被用于三萜類(lèi)物質(zhì)的定性定量分析，該法具有分析范圍廣、速度快、分離效能高、分析高效、高分辨率、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[30]。但是該法一般是以極少數(shù)的幾種三萜為標(biāo)準(zhǔn)品，相應(yīng)地測(cè)定原料中某幾種三萜的含量，而對(duì)于總?cè)坪康臏y(cè)定仍存在困難。將牛樟芝總?cè)拼痔嵛锝?jīng)酸堿沉降和萃取洗滌分離純化后，在最佳流動(dòng)相為甲醇∶水=90∶10（體積比）的條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，可以得到與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積[17]。

2.2.4 液質(zhì)聯(lián)用色譜法

液質(zhì)聯(lián)用色譜法具有低耗樣量、低流速、分析范圍廣、線(xiàn)性范圍寬、靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短等其他方法所不可比擬的優(yōu)勢(shì)，這些優(yōu)勢(shì)可以克服分析中三萜類(lèi)化合物成分復(fù)雜、基質(zhì)抑制效應(yīng)顯著、吸收性強(qiáng)的困難。徐萌萌[31]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)牛樟芝胞內(nèi)三萜類(lèi)化合物進(jìn)行分離鑒定，共鑒定出6種羊毛甾烷類(lèi)物質(zhì)，依次為3β，15α-二羥基羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸、3β，15α-二羥基羊毛甾-8，24（28）-二烯-21-酸、去氫硫色多孔菌酸、去氫齒孔酮酸、齒孔酸，這些物質(zhì)均具有很好的生物活性。

2.2.5 近紅外光譜法

近紅外光譜法是一種新型的綠色分析方法，具有準(zhǔn)確、快速及非侵入式分析等優(yōu)點(diǎn)，該法已廣泛應(yīng)用于食品和藥品的定性及定量分析。近紅外光譜是電磁輻射波的一種，波長(zhǎng)范圍是780 nm～2 500 nm，與分子中C-H、O-H、N-H和S-H基團(tuán)振動(dòng)的合頻以及各級(jí)振頻相關(guān)。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行近紅外光譜分析，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比，特征峰基本一致，將分離純化后的牛樟芝三萜物質(zhì)進(jìn)行近紅外光譜分析，得到譜圖中的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的基本一致[17]。初秋博等[32]應(yīng)用近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立牛樟芝菌絲體樣品中多糖和三萜組分的定量分析模型，能夠快速、準(zhǔn)確和無(wú)損地對(duì)牛樟芝及其誘變菌株的菌絲體樣品的有效成分進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，牛樟芝得到了諸多關(guān)注，同時(shí)國(guó)內(nèi)外的專(zhuān)家學(xué)者也對(duì)牛樟芝中三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)成分、提取方式及檢測(cè)方法進(jìn)行了廣泛、深入研究。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，牛樟芝中三萜類(lèi)化合物的提取工藝和檢測(cè)方法都在不斷改進(jìn)，只有充分利用新工藝新技術(shù)新方法才能使牛樟芝三萜類(lèi)化合物的研究更加便捷、深入地開(kāi)展，才能真正實(shí)現(xiàn)對(duì)牛樟芝三萜類(lèi)藥食同源產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)。