TGF-β1對AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞表面積和心鈉素合成影響

聶明，金培印

心肌缺血、高血壓等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與心肌肥厚有關(guān)，是心臟受到多種刺激以后產(chǎn)生的一種代償性的反應(yīng)，是猝死、心力衰竭等發(fā)生的危險(xiǎn)因素，腎素-血管緊張素系統(tǒng)是心室肥厚發(fā)生的重要原因，而血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中重要的促心肌細(xì)胞肥大因子[1,2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）具有廣泛的生物學(xué)作用，其是生長因子超家族中的一員，在胚胎發(fā)育、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等過程中具有重要作用[3,4]。近年來的研究顯示，TGF-β1參與心力衰竭發(fā)生，在心力衰竭大鼠模型中表達(dá)升高，并且可以調(diào)控細(xì)胞的生長、凋亡等過程，在心肌纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)的異常增多等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，探討TGF-β1在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大中的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組出生72 h的SD乳鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供；參照文獻(xiàn)[7]，取出生72 h的SD乳鼠，用乙醚麻醉以后，取出心臟，用眼科剪把心肌組織剪碎（＜1 mm3），添加5倍體積的消化酶（0.125%胰蛋白酶+0.04%的EDTA），混合后，在提前預(yù)熱的37℃的水浴中消化5 min。靜置3 min，把上清吸除。在沉淀中加入5倍體積的0.1%的Ⅰ型膠原酶，繼續(xù)在37 ℃的水浴中消化5 min。吸取上清，加入到15%胎牛血清的DMEM中，重復(fù)用Ⅰ型膠原酶消化直至組織消化完全。將消化后的所有上清以1200 g離心10 min，在細(xì)胞沉淀中加入PBS洗滌2次。用15%胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞，按照約106個(gè)細(xì)胞/ml種植到細(xì)胞瓶中，貼壁差1 h分離心肌細(xì)胞。心肌細(xì)胞經(jīng)α-actin免疫組化測定分離的心肌細(xì)胞純度超過95%。原代的心肌細(xì)胞分為5組，分別為：對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組。AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加0.1 μmol/L的AngⅡ；實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組在實(shí)驗(yàn)0 h時(shí)同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加20、30、40 μmol/L的TGF-β1抑制劑SB431542；對照組為常規(guī)條件下培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞。

1.2 主要試劑TGF-β1抑制劑SB431542購自美國Selleck；胰蛋白酶、AngⅡ、Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma；一氧化氮（NO）含量測定試劑盒購自上海翊圣生物；TRIZOL裂解試劑購自上海碧云天；TGF-β1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物為上海生工合成；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）一抗、smad2一抗購自美國PL Laboratories；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自北京博凌科為；心鈉素含量測定試劑盒購自北方免疫試劑研究所；辣根過氧化物標(biāo)記的二抗購自北京百奧萊博。

1.3 AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1 mRNA表達(dá)測定取心肌細(xì)胞，按照對照組和AngⅡ組方法分別處理48后，用TRIZOL提取各組心肌細(xì)胞中的RNA，測定RNA的A260/A280的比值處于1.8～2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行RT-PCR。TGF-β1上游引物（5，-3’）CTGGCGATACCTCAGCAAC，下游引物（5，-3’）TAAGGCGAAAGCCCTCAAT。G A P D H上游引物（5，-3’）CCTGCACCACCAACTGCTTAG，下游引物（5，-3，）CAGYCTTCTGGGTGGCAGTGA。2-△△Ct法以GAPDH為內(nèi)參分析TGF-β1水平。

1.4 AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)測定取心肌細(xì)胞，按照對照組和AngⅡ組方法分別處理48 h后，收集各組細(xì)胞，按照1000 g離心10 min，加入PBS洗滌2次，每次洗完以后1000 g離心10 min。再加入細(xì)胞裂解液，把細(xì)胞放在冰上孵育15 min。低溫4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 g，收集上清保存在-20 ℃冰箱中。待測蛋白樣品用BCA法定量，用Loading buffer煮沸變性以后，每個(gè)泳道內(nèi)添加50 μg的樣品，100 V電泳至溴酚藍(lán)距離底部2 cm處停止電泳。轉(zhuǎn)膜：電壓為90 V，電轉(zhuǎn)時(shí)間為90 min。封閉：在室溫，用5%脫脂奶粉封閉1 h。把TGF-β1一抗按照1:600稀釋，將膜放在稀釋后的一抗中，在4 ℃過夜。把二抗按照1:3000稀釋以后，把膜放在稀釋后的二抗中，在室溫孵育60 min。顯色，光密度掃描儀對蛋白進(jìn)行定量，GAPDH為內(nèi)參。

1.5 細(xì)胞表面積檢測對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選取10個(gè)細(xì)胞，用SimplePCI軟件檢測細(xì)胞的表面積，取均值。

1.6 心鈉素合成檢測用免疫放射法測定心肌細(xì)胞中心鈉素的表達(dá)。對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，收集培養(yǎng)液上清，與4 ℃預(yù)冷的7.5%的EDTA二鈉、抑肽酶混合后，在-20 ℃保存。按照心鈉素含量測定試劑檢測樣品中的心鈉素的含量。

1.7 心肌細(xì)胞蛋白含量檢測對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，消化細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，提取細(xì)胞蛋白，用蛋白含量測定試劑盒測定蛋白含量，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中蛋白含量。

1.8 NO含量測定對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，收集培養(yǎng)液上清，以硝酸還原法測定樣品中的NO含量，步驟參照試劑盒說明書。

1.9 Western blot測定Bcl-2、smad2蛋白水平對照組、AngⅡ組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h以后，按照上述材料與方法5中Western blot法測定各組心肌細(xì)胞中Bcl-2、smad2蛋白水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異之間的比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)

從圖1和表1可以看出，心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ處理后細(xì)胞中的TGF-β1 mRNA和蛋白水平均明顯升高，說明AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

圖1 Western blot測定AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1蛋白水平（TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶）

2.2 TGF-β1抑制后對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響從表2可以看出，AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞表面積明顯增加，并且心肌細(xì)胞合成的心鈉素水平也明顯升高，心肌細(xì)胞蛋白含量也明顯升高，而心肌細(xì)胞合成的NO含量下降。用不同濃度的TGF-β1抑制劑作用后的心肌細(xì)胞表面積有所降低，細(xì)胞合成的心鈉素減少，心肌細(xì)胞蛋白含量也下降，心肌細(xì)胞合成的NO水平升高。AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，減少NO合成，而TGF-β1抑制劑可以呈濃度依賴的拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)NO合成。

表1 AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1蛋白水平（±s）

表1 AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中TGF-β1蛋白水平（±s）

注：AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；與對照組相比，aP＜0.05；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1

組別 TGF-β1蛋白水平 TGF-β1 mRNA對照組 0.26±0.03 1.00 AngⅡ組 1.03±0.09a 3.87±0.36a t值 14.058 13.808 P值 0.000 0.000

2.3 TGF-β1抑制后對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡影響從圖2和表3可以看出，AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞凋亡率升高，而用不同濃度的TGF-β1抑制劑作用后的心肌細(xì)胞凋亡率下降。AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而TGF-β1抑制劑可以呈濃度依賴的減弱AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用。

2.4 TGF-β1抑制后對AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中Bcl-2、smad2蛋白表達(dá)影響從圖3和表4可以看出，AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平下降，smad2表達(dá)增多，而用不同濃度的TGF-β1抑制劑作用后的心肌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)增多，smad2表達(dá)減少。TGF-β1抑制劑可以呈濃度依賴的拮抗AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞中Bcl-2、smad2表達(dá)影響。

表2 各組細(xì)胞表面積、蛋白含量及合成心鈉素、NO水平比較（±s）

表2 各組細(xì)胞表面積、蛋白含量及合成心鈉素、NO水平比較（±s）

注：AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；NO：一氧化氮；與對照組相比，aP＜0.05；與AngⅡ組相比，bP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組相比，dP＜0.05

組別 細(xì)胞表面積（μm2） 心鈉素（ng/ml） 心肌細(xì)胞蛋白含量（pg） NO（μmol/L）對照組 1554.32±116.25 398.24±33.26 413.25±25.18 14.36±1.20 AngⅡ組 3351.26±235.68a 816.36±55.91a 984.61±65.87a 7.61±0.74a實(shí)驗(yàn)1組 2863.15±121.57b 632.17±28.65b 846.28±88.36b 12.31±1.24b實(shí)驗(yàn)2組 2361.87±237.29bc 538.64±33.28bc 746.32±69.97bc 14.59±1.47bc實(shí)驗(yàn)3組 1964.23±134.68bcd 461.97±27.86bcd 589.27±63.89bcd 18.72±1.83bcd F值 47.955 57.689 34.084 27.096 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

近年來，隨著對心肌肥厚的不斷研究，人們逐漸發(fā)現(xiàn)心肌重塑是心力衰竭發(fā)生的重要原因，在心肌重塑過程中常常伴隨著心肌細(xì)胞過度凋亡、心肌細(xì)胞肥大等病理學(xué)變化，這些病理變化可以引發(fā)心室容量異常增加、心室形狀異常等現(xiàn)象，造成心肌損傷[8]。TGF-β1是一種在血小板中發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)因子，是TGF-β異構(gòu)體中的一種，在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，其具有誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的形成、降低免疫反應(yīng)等作用[9]。TGF-β1參與人體的多種慢性纖維性疾病的發(fā)生，如腎小球腎炎、肺纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心肌纖維化等，TGF-β1過度表達(dá)是多種慢性纖維性疾病發(fā)生的重要原因[10,11]。最近的研究表明，TGF-β1在心力衰竭中高表達(dá)，且與心肌肥厚有關(guān)[12,13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中的TGF-β1 mRNA和蛋白水平均升高，這與上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道相一致，都說明TGF-β1與心肌肥厚有關(guān)。

心肌肥厚與心肌細(xì)胞肥大有關(guān)，而心肌細(xì)胞肥大主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞表面積增大和心鈉素合成增多，心鈉素是心肌細(xì)胞的胚胎基因，在心肌肥厚組織中表達(dá)增多[14]。NO具有調(diào)控心室重構(gòu)的作用，能夠傳導(dǎo)細(xì)胞信號和調(diào)控血管舒張，具有保護(hù)心肌組織的功能，其在心力衰竭心肌組織中水平下調(diào)[15]。很多研究報(bào)道表明，AngⅡ能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積增加，心鈉素合成增加，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞合成的NO水平降低，心鈉素合成增加，細(xì)胞表面積增加，細(xì)胞中的蛋白含量增加，而TGF-β1抑制劑可以逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)細(xì)胞合成NO，抑制TGF-β1具有保護(hù)心肌組織的作用。

圖2 TGF-β1抑制劑對AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞凋亡影響

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；與對照組相比，aP＜0.05；與AngⅡ組相比，bP＜0.05;與實(shí)驗(yàn)1組相比，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組相比，dP＜0.05

組別 細(xì)胞凋亡率（%）對照組 6.87±0.67 AngⅡ組 31.68±3.61a實(shí)驗(yàn)1組 25.61±2.38b實(shí)驗(yàn)2組 20.36±2.15bc實(shí)驗(yàn)3組 14.28±1.28bcd F值 55.033 P值 0.000

圖3 Western blot測定細(xì)胞中Bcl-2、smad2蛋白水平

表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、smad2蛋白水平比較（±s）

表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、smad2蛋白水平比較（±s）

注：AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；與對照組相比，aP＜0.05；與AngⅡ組相比，bP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)1組相比，cP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2組相比，dP＜0.05

組別 Bcl-2蛋白 smad2蛋白對照組 1.18±0.21 0.36±0.05 AngⅡ組 0.20±0.01a 1.42±0.18a實(shí)驗(yàn)1組 0.39±0.02b 0.95±0.07b實(shí)驗(yàn)2組 0.57±0.05bc 0.66±0.05bc實(shí)驗(yàn)3組 0.91±0.07bcd 0.45±0.07bcd F值 45.072 58.592 P值 0.000 0.000

心肌肥厚發(fā)生以后，心肌細(xì)胞在高負(fù)荷的刺激下體積不斷增加，心臟為了維持心肌組織的正常功能而啟動(dòng)凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，這樣就使得心肌肥厚由原來的代償期逐漸轉(zhuǎn)化為失代償期，造成心肌數(shù)目異常減少，導(dǎo)致心功能受損，進(jìn)一步促進(jìn)心肌肥厚發(fā)展為心力衰竭[17]。AngⅡ不僅能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而且還能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2是與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)水平升高后可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1被抑制后可減少AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，說明TGF-β1對心肌細(xì)胞肥大的作用機(jī)制可能與減少心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

TGF-β1在細(xì)胞膜上與其受體特異性結(jié)合以后，可以促進(jìn)其下游的受體激活，而smad2是這一過程中的調(diào)節(jié)型受體，TGF-β1與smad2結(jié)合形成異聚體以后可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[20,21]。smad2已經(jīng)被證實(shí)參與心肌肥厚的發(fā)生，在心肌肥厚組織中表達(dá)上調(diào)[22]。本實(shí)驗(yàn)顯示，AngⅡ促進(jìn)心肌細(xì)胞中smad2的表達(dá)，而TGF-β1被抑制以后可以降低細(xì)胞中smad2蛋白水平，這提示TGF-β1可能通過作用于smad2影響AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，而對于其具體的作用機(jī)制仍需日后進(jìn)行探討和驗(yàn)證。

AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中TGF-β1高表達(dá)，下調(diào)TGF-β1可以減弱AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞肥大的誘導(dǎo)作用，這可能與減少心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)NO合成和減少smad2蛋白表達(dá)有關(guān)，本研究在原代心肌細(xì)胞中進(jìn)行了探討，以后會(huì)在多株心肌細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為明確TGF-β1在心肌肥厚中的作用奠定基礎(chǔ)。