拋物線布點法在灘涂貝類養(yǎng)殖區(qū)微生物監(jiān)測中的應用

陳 瑜，張小軍，嚴忠雍，何依娜，許 丹

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江 舟山 316021)

微生物是港灣生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 在物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要的作用，其數(shù)量及生物多樣性可以作為海洋環(huán)境監(jiān)測的生物學指標。港灣生態(tài)系統(tǒng)相對獨立，在水動力等自然條件作用下，受海洋開發(fā)活動及外來污染影響尤為突出，由于人類對港灣資源的過度開發(fā)利用，沿灣地區(qū)環(huán)境污染日趨嚴重，直接引起病原微生物的大量滋生，破壞港灣生態(tài)系統(tǒng)平衡。貝類是一種非選擇濾食性生物，在生長過程中易積累和富集環(huán)境中的病原微生物[1]。富集的微生物通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，會嚴重危害身體健康[2]。因此，開展灘涂貝類及生長環(huán)境的微生物監(jiān)測以及貝類養(yǎng)殖環(huán)境評價[3]，對灘涂貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展及貝類食品安全具有重要的意義[4]。

農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局從2003年起，對我國主要貝類養(yǎng)殖海區(qū)的環(huán)境狀況以及養(yǎng)殖貝類衛(wèi)生狀況進行了分類管理工作[5]。同時，經(jīng)過多年的貝類劃型工作和長期的總結(jié)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)：貝類監(jiān)測點的布設決定著監(jiān)測數(shù)據(jù)能否有效地反映研究區(qū)域的環(huán)境質(zhì)量狀況，是貝類監(jiān)測和劃型的重要一環(huán)，但對于不同類型的養(yǎng)殖生產(chǎn)海域還沒有明確的監(jiān)測站位布設原則和方法。因此，本研究根據(jù)樂清灣北部貝類養(yǎng)殖生產(chǎn)區(qū)所屬海域，提出了港灣灘涂貝類養(yǎng)殖生產(chǎn)海域監(jiān)測站位布設原則和方法，并對建立的監(jiān)測站位布設原則和方法進行驗證和結(jié)果評價，為完善貝類劃型工作方案提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱(型號GHP-9270)；智能光照培養(yǎng)箱(型號(GXZ)；生物安全柜(型號 BSC-1000ⅡA2)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(型號YXQ-LS-50G)；其他實驗室常用設備。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、EC肉湯(E.coli broth)、伊紅美藍(EMB)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、平板計數(shù)瓊脂(PCA)、2216E瓊脂、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、HBI生化鑒定試劑盒，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。所有培養(yǎng)基均需121 ℃高壓滅菌20min；其余為實驗室常用試劑。

1.3 貝類監(jiān)測點確定及試驗方法

1.3.1 監(jiān)測點的確定

本研究以樂清灣北部為貝類研究海域，即樂清灣以北開展貝類產(chǎn)品采樣布點。并以北緯28.278 N為橫軸，東經(jīng)121.186 E為縱軸，港灣頂端為拋物線頂點，沿港灣海岸線畫拋物線。其中X軸標尺約850 m，Y軸標尺約710 m。以坐標軸0為中心，每一個X軸標尺為橫坐標在拋物線上布點，如圖1。此時，有15個監(jiān)測點被初步確定，但由于不是所有的點都是貝類養(yǎng)殖點，通過對灘涂貝類實際養(yǎng)殖情況的調(diào)查研究，13個監(jiān)測點被最終確認。如圖2。監(jiān)測點具體坐標及地理位置如表1所示。

對于以上選取的13個監(jiān)測點，分別于8月、9月和10月進行3個批次的縊蟶樣品抽樣檢測，每個樣品做三個重復。

采集的縊蟶分別放置在無菌的拉鏈袋中，然后在4 °C保存，在采集后24 h內(nèi)進行處理，在實驗室中用干凈的自來水沖洗，用75%消毒棉球擦洗，用無菌鉗打開。

1.3.2 貝類大腸桿菌和菌落總數(shù)的檢測

大腸桿菌按照GB4789.38-2012食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)。將貝類撬殼稱取25 g 肉，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，制作成1∶10的樣品勻液。選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過初發(fā)酵、復發(fā)酵和生理生化試驗，計數(shù)陽性管數(shù)，查MPN 表。

菌落總數(shù)按照GB4789.2-2010食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定。將貝類撬殼稱25 g肉，放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，制作成1∶10 的樣品勻液。然后，選擇合適的3 個稀釋度，每個稀釋度做2個平板，用滅菌冷卻至46 ℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，( 30±1) ℃培養(yǎng)( 72±3) h。選擇菌落數(shù)在30～300 CFU之間連續(xù)兩個稀釋度的平板，按公式計算樣品中均落數(shù)。

圖1 初定貝類監(jiān)測點

監(jiān)測點經(jīng)緯度地理位置1E 121°06.922 N 28°16.697樂清市清江鎮(zhèn)2E 121°08.233 N 28°18.126樂清市清江鎮(zhèn)3E 121°08.712 N 28°19.590樂清市雁蕩鎮(zhèn)4E 121°10.053 N 28°20.671樂清市雁蕩鎮(zhèn)5E 121°10.755 N 28°22.313樂清市大荊鎮(zhèn)6E 121°11.301 N 28°22.915樂清市湖霧鎮(zhèn)

表1(續(xù))

1.4 海水監(jiān)測點確定及試驗方法

1.4.1 海水監(jiān)測點確定

布點方法參照貝類產(chǎn)品拋物線，以北緯28.278 N為橫軸，東經(jīng)121.186 E為縱軸，港灣頂端為拋物線頂點，沿港灣海岸線畫拋物線。以坐標軸0為中心，每隔三個X軸標尺為橫坐標在拋物線上布點，得到7個海水監(jiān)測點(1，3，4，6，7，8和10)，同時，在坐標軸Y軸上取3個監(jiān)測點(2，5和9)做對照，最終10個海水監(jiān)測點被確定，如圖3。

分別于8月、9月和10月對以上選取的10個海水監(jiān)測點進行3個批次的海水樣品抽樣檢測，每個樣品做三個重復。

圖3 海水站位監(jiān)測點

監(jiān)測點經(jīng)緯度1E 121°07.512 N 28°16.6802E 121°11.160 N 28°16.6803E 121°14.327 N 28°16.6804E 121°08.905 N 28°19.4765E 121°11.160 N 28°19.4766E 121°13.293 N 28°19.4767E 121°10.164 N 28°20.7258E 121°13.174 N 28°20.7259E 121°11.160 N 28°21.67010E 121°11.160 N 28°22.796

1.4.2 海水糞大腸菌群和細菌總數(shù)的測定

海水中糞大腸菌群和細菌總數(shù)的檢測按照GB17378.7-2007海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測。

糞大腸菌群的檢測。將3個適宜梯度的的海水樣品接種到44 ℃乳糖蛋白胨肉湯中，每個梯度接種5管，置于恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，將有產(chǎn)酸和產(chǎn)氣跡象的乳糖蛋白胨管傳代到EC肉湯中進行復發(fā)酵試驗，在恒溫培養(yǎng)箱44±0.5 ℃下培養(yǎng)24 h。在此期間產(chǎn)酸且產(chǎn)氣的即為陽性管，通過查表得糞便大腸菌群MPN值。

菌落總數(shù)的檢測。以無菌操作吸取1ml水樣注入盛有9mL滅菌陳海水的試管內(nèi)混合，并依同法依次連續(xù)稀釋至所需要的稀釋度(倍數(shù))。稀釋度依水樣含菌量而定，選擇合適的3 個稀釋度，每個稀釋度做2個平板，用滅菌冷卻至25 ℃的2216E瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，25℃培養(yǎng)7d。選擇菌落數(shù)在30～300 CFU之間連續(xù)兩個稀釋度的平板，按公式計算樣品中均落數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過lg X轉(zhuǎn)化，統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，最后通過EXCEL做圖。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 貝類樣品微生物監(jiān)測結(jié)果分析

從大腸桿菌分布圖(圖4)可以看出，縊蟶樣品中大腸桿菌的數(shù)量沿樂清灣北部沿岸呈類似拋物線分布。大腸桿菌的數(shù)值在樂清灣頂部縊蟶樣品中表現(xiàn)最高，并且沿貝類河床往下呈減少趨勢。其中，監(jiān)測點5，6，7和8抽取的縊蟶樣品中大腸桿菌的數(shù)值顯著性高于其它監(jiān)測點，而且在三次監(jiān)測中均超出二類貝類生產(chǎn)區(qū)4600 MPN/100 g的限值。另外，監(jiān)測點1(包含三個批次)和監(jiān)測點10(包含兩個批次)的縊蟶樣品中大腸桿菌的數(shù)值也都超過了4600 MPN/100 g的限值。其它監(jiān)測點的縊蟶樣品大腸桿菌數(shù)值均未超過4600 MPN/100 g的限值。

從菌落總數(shù)分布圖(圖5)可以看出，與大腸桿菌分布相似，縊蟶樣品中菌落總數(shù)的數(shù)量也呈類似拋物線分布。處于拋物線頂端的監(jiān)測點5，6，7和8抽取的縊蟶樣品中菌落總數(shù)的數(shù)值顯著性高于其它監(jiān)測點，此外，監(jiān)測點1和監(jiān)測點10的縊蟶樣品中菌落總數(shù)的數(shù)值也相對偏高。因此，縊蟶中大腸桿菌與菌落總數(shù)的數(shù)值呈一定的正相關(guān)。

圖4 不同站位大腸桿菌數(shù)量(8～10月)

Fig.4 The numbers of E.coli within S.constricta flesh fromdifferent sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

圖5 不同站位菌落總數(shù)數(shù)量(8～10月)

Fig.5 The numbers of ACC within S.constricta flesh from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

2.2 海水樣品微生物監(jiān)測結(jié)果分析

從糞大腸菌群分布圖(圖6)可以看出，位于樂清灣頂部(即拋物線頂點附近)監(jiān)測點7～10采集的海水樣品中，糞大腸菌群的數(shù)量顯著性高于其它監(jiān)測點。相反地，監(jiān)測點2～6海水中糞大腸菌群的數(shù)值較低。然而，監(jiān)測點1的海水卻表現(xiàn)出較高含量的糞大腸菌群。結(jié)合貝類監(jiān)測點采集的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)縊蟶中大腸桿菌與海水中糞大腸菌群的含量呈一定的正相關(guān)。另外，通過對比同一緯度線上三個點(1, 2, 3 和 4, 5, 6)，糞大腸菌群數(shù)值呈現(xiàn)中間低兩邊高的趨勢，即位于中間監(jiān)測點采集的海水比沿岸監(jiān)測點采集的海水糞大腸菌群數(shù)值相對較低。一些研究已經(jīng)證明，地表徑流、污水排放和港口開發(fā)等都會直接導致近岸海域海水糞大腸菌群含量的增加。因此離沿岸和人類生活區(qū)距離越近其海水中糞大腸菌群數(shù)值就越高，這與本研究的結(jié)果一致。此外，監(jiān)測點1位于清江入?？?，監(jiān)測點8位于江廈排撈隧洞入海口，這兩個監(jiān)測點更容易受污染而表現(xiàn)出高含量的糞大腸菌群。

分析細菌總數(shù)分布圖(圖7)，沒有發(fā)現(xiàn)顯著性的規(guī)律，而且海水中細菌總數(shù)和糞大腸菌群的含量并沒有顯示相關(guān)性。

圖6 不同站點海水糞大腸菌群數(shù)量(8～10月)

Fig.6 The numbers of faecal coliform within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

圖7 不同站點細菌總數(shù)含量(8～10月)

Fig.7 The numbers of TBC within seawater samples from different sampling sites,over differing temporal scales (from August to October)

3 樂清灣貝類產(chǎn)區(qū)劃分分析

港灣的海水交換能力是海水微生物含量一個重要的影響因素，海水的交換速率直接決定了海水的自凈能力[6]。在本研究中，貝類監(jiān)測點5，6，7 和 8位于樂清灣的頂端，其海水交換速率相對較慢，因此，該區(qū)域海水和貝類中糞便指示菌的含量要顯著性高于其它監(jiān)測點。監(jiān)測數(shù)據(jù)也顯示了該區(qū)域采集的縊蟶樣品其大腸桿菌含量顯著性偏高，而且超過了二類生產(chǎn)區(qū)4600 MPN/100g的限值。依據(jù)(農(nóng)漁發(fā)[2016]8號)文件和三次貝類監(jiān)測數(shù)據(jù)，我們建議以監(jiān)測點8為界，即28.367 N以北的樂清灣北部海區(qū)劃為三類貝類生產(chǎn)區(qū)[7]，如圖8。一些研究表明當長期暴露于受污染的海水環(huán)境中時，貝類會富集高濃度的糞便病原菌[8-9]。在本研究中，貝類監(jiān)測點1和10位于江河入?？冢虼嗽搮^(qū)域貝類生長海水極易受生活污水、養(yǎng)殖尾水、工業(yè)廢水和生產(chǎn)活動等的影響。監(jiān)測數(shù)據(jù)也顯示了在采集的縊蟶樣品中，來自監(jiān)測點1的三個批次和監(jiān)測點10的兩個批次的縊蟶樣品其大腸桿菌數(shù)值過了二類生產(chǎn)區(qū)4600 MPN/100g的限值。然而，對于該區(qū)域附近的其它監(jiān)測點，采集的三批次縊蟶樣品均未超過4600 MPN/100g。因此，綜合考慮，將28.367 N以南，28.278 N以北的樂清灣北部海域劃為二類貝類生產(chǎn)區(qū)，同時要重點加強對貝類監(jiān)測點1和10的監(jiān)測，如圖8。

圖8 樂清灣貝類產(chǎn)區(qū)劃分示意

4 結(jié)論

本研究將拋物線定點法初步運用于港灣灘涂貝類養(yǎng)殖生產(chǎn)海域的貝類及生長海水站位布設。研究表明，縊蟶樣品大腸桿菌和菌落總數(shù)的數(shù)量沿樂清灣北部沿岸均呈類似拋物線的分布，其數(shù)值在樂清灣頂部采集的縊蟶樣品中顯示最高，并且沿貝類河床往下呈減少趨勢。且大腸桿菌與菌落總數(shù)的數(shù)值呈一定的正相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)縊蟶大腸桿菌與海水糞大腸菌群的含量也呈一定的正相關(guān)。另外，通過對比同一緯度線上三個點，糞大腸菌群數(shù)值呈現(xiàn)中間低兩邊高的趨勢，即位于中間監(jiān)測點采集的海水比沿岸監(jiān)測點采集的海水糞大腸菌群數(shù)值相對較低。分析細菌總數(shù)含量分布圖，沒有發(fā)現(xiàn)顯著性地規(guī)律。最后，依據(jù)(農(nóng)漁發(fā)[2016]8號)文件和三次貝類監(jiān)測數(shù)據(jù)，綜合考慮將8.367 N以北的樂清灣北部海區(qū)劃為三類貝類生產(chǎn)區(qū)，將28.367 N以南，28.278 N以北的樂清灣北部海域劃為二類貝類生產(chǎn)區(qū)，同時要重點加強對貝類監(jiān)測點1和10的監(jiān)測。