金錢草中多酚超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

楚紅英， 羅 曉， 李 瑜

(1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封 475004； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450003；3.鄭州頤和醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州 450047)

金錢草為報春花科珍珠菜屬植物過路黃的新鮮或干燥全草[1]，全草供藥用，有清熱利尿、祛風(fēng)止痛、止血生肌、消炎解毒、殺蟲之功效[2]，可治急慢性肝炎、黃疸型肝炎、膽囊炎、腎炎、細菌感染、尿路結(jié)石、泌尿系統(tǒng)感染、扁桃腺炎、口腔炎、癰疔療毒、毒蛇咬傷、乳癰、痢疾、瘧疾、肺出血、小兒疳積、蕁麻疹等疾病[3-6]。金錢草含有黃酮類、酚類、苷類、內(nèi)脂類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、氯化鉀等成分[7-8]。對植物中酚類化合物進行定量測定，國內(nèi)外常用的方法有高錳酸鉀滴定法、酒石酸亞鐵分光光度法、Folin-Ciocalteu-分光光度法、鐵氰化鉀分光光度法、香草醛法、原子吸收分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、高效液相色譜法等方法[9-15]。本試驗用溶劑超聲輔助對金錢草中的多酚進行提取，以沒食子酸作為標準品，用酒石酸亞鐵分光光度法對金錢草中多酚測定進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本試驗所用的金錢草購于某醫(yī)藥大廈。

主要試劑：沒食子酸標準品(純度≥98%)，購自Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純，試驗用水為2次蒸餾水。

主要儀器：PB1502-L梅特勒分析天平，購自瑞士梅特勒公司；醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器，購自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；恒溫干燥箱，購自上海智誠分析儀器制造有限公司；水循環(huán)真空泵，購自河南智誠科技有限公司；傾斜式高速萬能粉碎機，購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司制造；V-1200型可見分光光度計，購自上海美譜達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取干燥的沒食子酸0.250 0 g溶解后轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶內(nèi)定容。分別移取沒食子酸標液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL于10 mL容量瓶中，用蒸餾水補至2 mL，加入2 mL酒石酸亞鐵溶液，用磷酸緩沖溶液定容，放置30 min，在D540 nm處測其吸光度[16]，以沒食子酸標準系列溶液的濃度為橫坐標，以對應(yīng)的吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線。線性回歸方程為y=0.109 4x+0.025 9，r=0.999 8(n=6)，濃度在0～2.00 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

1.2.2 金錢草中多酚的提取 將金錢草依次用自來水、蒸餾水洗凈之后，在100 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎，用20目篩子過篩，密封保存于棕色瓶中備用。稱取一定量的金錢草粉末于錐形瓶中，按要求加入提取劑，在一定條件下進行超聲提取，提取功率為300 W，抽濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，將濾液定容至50 mL容量瓶中作為待測試樣。

1.2.3 樣品中多酚含量的測定 準確吸取待測試樣 2.00 mL 于10 mL容量瓶中，加入2.00 mL酒石酸亞鐵溶液，用磷酸緩沖溶液定容至10 mL，在D540 nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算多酚含量。

1.2.4 金錢草多酚體外抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH·清除能力測定 取1 mL不同濃度的金錢草多酚提取液，分別加入盛有2.00 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液的試管中，25 ℃下避光放置30 min，于517 nm處測其吸光度Di；2.00 mL DPPH溶液加2.00 mL無水乙醇的吸光度Dc，2.00 mL金錢草多酚溶液和2.00 mL無水乙醇吸光度為Dj[17-19]，按式(1)計算清除率：

(1)

1.2.4.2 ·OH清除率測定 在試管中依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵銨、9 mmol/L水楊酸-乙醇各1.00 mL，分別加入不同濃度的金錢草多酚試液1.00 mL，0.03 mL 8.8 mmol/L雙氧水，以蒸餾水作空白對照，維生素C作陽性對照，于37 ℃下反應(yīng)30 min，于510 nm處測定吸光度Dx，空白對照D0，樣品本底吸光度Dx0用蒸餾水代替雙氧水。按式(2)計算清除率[17-19]。

(2)

(3)

1.2.4.4 脂質(zhì)體系中抗氧化能力測定 在試管中依次加入1mL LLS(300 mg卵磷脂溶于30 mL pH值7.4的10 mmol/L磷酸緩沖液)、1 mL 400 mmol/L FeCl3、1 mL樣品、1 mL三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-鹽酸(HCl)混合液，避光沸水煮15 min，迅速冷卻，離心取上清液在532 nm處測吸光度Ds，以1 mL蒸餾水為空白對照測吸光度Dc[17-19]。按式(4)計算脂質(zhì)體系的抑制率。

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

試驗以 1.0 g 金錢草作為提取對象，確定多酚初始提取工藝參數(shù)為：液料比30 mL ∶1 g；提取溫度40 ℃，提取時間 30 min，丙酮體積分數(shù)30%，按“1.2.2”節(jié)的方法提取多酚。試驗過程中，固定其他3個因素，變化其中1個因素，分別對提取溫度、液料比、丙酮體積分數(shù)、提取時間4個因素進行單因素探索，以考察各因素對金錢草多酚提取率的影響。

2.1.1 提取溫度對多酚提取率的影響 由圖1可知，隨著提取溫度的升高，多酚物質(zhì)的提取率先增加后降低，在50 ℃時多酚提取率達到13.2 mg/g，此后隨著溫度增加，多酚提取率呈現(xiàn)降低趨勢，可能是隨著溫度的升高，丙酮揮發(fā)加快，金錢草中多酚類物質(zhì)不能被充分溶解，因此多酚提取率下降較快。

2.1.2 液料比對多酚提取率的影響 液料比是影響多酚提取率的重要因素之一，適當?shù)囊毫媳炔粌H能使原料中的多酚物質(zhì)得到充分提取，而且可減少溶劑的浪費和節(jié)省提取成本。由圖2可知，隨著液料比的增加，多酚提取率逐漸增加，當液料比為30 mL ∶1 g時，多酚提取率為13.0 mg/g，隨后液料比增加，提取率基本保持平穩(wěn)，考慮到液料比越大成本越高，故宜選用液料比為30 mL ∶1 g。

2.1.3 提取時間對多酚提取率的影響 由圖3可知，隨著提取時間的增加，多酚物質(zhì)的提取率也在增加，當時間超過 40 min 以后，提取率增加幅度不大，故適宜的提取時間應(yīng)在40 min左右。

2.1.4 丙酮體積分數(shù)對多酚提取率的影響 由圖4可知，隨著丙酮體積分數(shù)的升高，多酚的提取率增加，當丙酮體積分數(shù)為80%時，多酚提取率達到13.5 mg/g，此后丙酮體積分數(shù)增加，多酚提取率呈現(xiàn)降低趨勢。這可能是由于其他物質(zhì)的溶解，降低了多酚的溶解度。

2.2 正交試驗設(shè)計

試驗選擇丙酮體積濃度、液料比、提取時間、提取溫度為考察因素，分別確定3個水平進行試驗，采用L9(34)正交設(shè)計表安排，每個試驗號重復(fù)3次，取其平均值，正交設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1 金錢草中多酚類化合物提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果

上述試驗結(jié)果表明，各影響因子的主次關(guān)系為液料比=丙酮體積分數(shù)>提取溫度>提取時間，最佳方案為A2B2C3D2(即提取溫度40 ℃，液料比30 mL ∶1 g，提取時間50 min，丙酮體積分數(shù)60%)。按A2B2C3D2條件下重復(fù)測定5次，多酚的提取率分別為17.45、16.91、17.64、16.98、17.68 mg/g，平均值為17.33 mg/g，相對標準差RSD為2.09%。

正交試驗的方差分析旨在研究各因素對多酚提取率的影響程度。由表2可知，液料比對試驗結(jié)果影響極顯著；丙酮體積分數(shù)對試驗結(jié)果影響顯著；提取溫度、提取時間對試驗最后結(jié)果影響較小。

2.3 多酚抗氧化結(jié)果分析

測定多酚抗氧化時，均以相應(yīng)濃度的維生素C作陽性對照。

2.3.1 金錢草多酚對DPPH·的清除能力 由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著金錢草多酚濃度的增加，DPPH·的清除能力增強，但金錢草多酚的清除率不及維生素C的清除率。當金錢草多酚濃度為50 μg/L時，對DPPH·的清除率達到20.6%，等濃度的維生素C對DPPH·的清除率達到85.2%；當金錢草多酚濃度為500 μg/L時，DPPH·的清除率達到68.3%，等濃度的維生素C對DPPH·的清除率達到98.8%。

表2 正交試驗設(shè)計結(jié)果方差分析

注：*、**分別表示不同處理對試驗結(jié)果影響顯著、極顯著。

2.3.2 金錢草多酚對·OH清除率的測定 由圖6可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，對·OH的清除能力隨著金錢草多酚濃度的增加而增加，但其對·OH的清除能力不及維生素C。當金錢草多酚濃度為50 μg/L時，對·OH的清除率達到31.3%，等濃度的維生素C對·OH的清除率為76.7%；當金錢草多酚濃度為500 μg/L時，對·OH的清除率達到87.6%，維生素C在此濃度下對·OH的清除率達99.8%。

2.3.4 金錢草多酚還原能力的測定 由圖8可知，隨著金錢草多酚及維生素C濃度的增加，吸光度逐漸增大，也就是說Fe3+還原能力隨著多酚及維生素C濃度的增加越來越強；且等濃度多酚還原能力不及維生素C強。

2.3.5 脂質(zhì)體系中抗氧化能力的測定 由圖9可知，金錢草多酚在試驗濃度范圍內(nèi)的抑制率隨著多酚濃度的增加而增加，維生素C的清除效果要比多酚的清除效果好，當多酚濃度為50 μg/L時，金錢草多酚對脂質(zhì)體系抑制率為21.0%，而維生素C在此濃度下對脂質(zhì)體系抑制率為75.0%；濃度為500 μg/L時，金錢草多酚對脂質(zhì)體系中抑制率為75.2%，而維生素C在此濃度下對脂質(zhì)體系中抑制率為99.2%。

3 結(jié)論