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    結(jié)腸癌中組蛋白乙?;揎椝降淖兓?/h1>
    2018-11-08 10:09:28陳忠勝羅義琳李梁和田斌鄭璐田甜余蕾廖欣詹瑋
    中國普通外科雜志 2018年10期
    關鍵詞:乙?;?/a>結(jié)腸癌結(jié)腸

    陳忠勝,羅義琳,李梁和,田斌,鄭璐,田甜,余蕾, ,廖欣,詹瑋,

    (貴州醫(yī)科大學 1.研究生院 2.病理生理學教研室,貴州 貴陽 550004;3.貴州省婦幼保健醫(yī)院 病理科,貴州 貴陽550004;貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 4.影像科 5.普通外科,貴州 貴陽 550004)

    結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,隨著人口老齡化、遺傳、生活方式(如喝酒、吸煙、飲食等)以及環(huán)境的改變,結(jié)直腸癌的高發(fā)病率居高不下,目前,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的前三,其病死率也高達第4位[1]。據(jù)2015年一項流行病學數(shù)據(jù)顯示,盡管腫瘤的根治性切除的改進,增加了患者的5年生存率,我國結(jié)直腸癌病死率高達50%以上[1-2]。而結(jié)直腸癌是一種具有高度特異性的惡性腫瘤,其在臨床病理特征、組織形態(tài)、免疫表型、治療效果以及生物學行為等方面存在較大差異,腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍然是患者重要的死亡原因[3-4]。

    組蛋白修飾在疾病的研究中備受關注,其中組蛋白甲基化修飾及乙酰化修飾在腫瘤方面的研究更為常見。組蛋白乙?;揎椏捎绊懠毎麅?nèi)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),從而參與了相應位點的基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控,在腫瘤細胞生長和分化過程中起重要作用。因此,本實驗著重觀察結(jié)腸癌細胞株SW480及結(jié)腸癌組織中組蛋白乙?;揎椀南鄳稽c的變化情況,以期了解組蛋白乙?;揎椩诮Y(jié)腸癌中的修飾情況,為后續(xù)進一步的有關結(jié)腸癌在組蛋白乙?;揎椃矫娓钊氲难芯孔龊们捌趯嶒灮A。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460及人結(jié)腸癌細胞株SW480均購于上海歌凡生物科技有限公司。使用NCCN指南中關于結(jié)腸癌的診斷標準,通過腹部增強CT、腸鏡及病理活檢選取了10例明確診斷為無遠處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的可行手術(shù)治療的患者,取出患者手術(shù)切下的腸段,分別選取正常結(jié)腸組織及結(jié)腸腫瘤組織(均通過病理檢測證實)。

    1.2 主要試劑

    胎牛血清購自Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司;DNaseⅠ、彩虹Marker購自Solarbio;細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Alexa Fluor488標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、DyLight549標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;E-Plate檢測板購于埃森生物(杭州)有限公司,acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體均購自Abcam公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 體外細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清及含青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于5%、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),定期換液傳代,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.3.2 提取細胞核及核蛋白制備 將細胞及組織利用核漿分離技術(shù)提取目的核蛋白。按每1×106個細胞加入裂解液100 μL核蛋白酶抑制劑1 μL的比例冰上裂解30 min,1 200 r/min低溫離心10 min,提取細胞的核蛋白,-80 ℃保存。

    1.3.3 組織標本處理 將選取的正常結(jié)腸組織及結(jié)腸腫瘤組織,用EP管分裝,存于-80 ℃冰箱備用。

    1.3.4 Western blot分析組蛋白乙酰化狀態(tài) 將提取的細胞及組織的核蛋白,以100 g/L或120 g/L的SDS-PAGE分離,濕法電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜,室溫下?lián)u床封閉1 h,加入不同濃度的一抗(組蛋白乙?;揎椢稽c acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體1:1 000,H3抗體1:400),4 ℃過夜,TBS洗滌液洗膜后分別放入用TBS按1:1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗,室溫下?lián)u床作用1 h,TBS洗滌液洗膜后化學發(fā)光法顯色,X線片曝光,以H3為內(nèi)參照。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 Western blot法檢測正常結(jié)腸上皮細胞與結(jié)腸癌細胞組蛋白乙?;揎椝?/h3>

    使用Western blot檢測NCM460與SW480細胞的acH3K9、acH3K14、acH3K18乙?;揎椝?。結(jié)果顯示,與NCM460比較,SW480細胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平明均顯下調(diào)(均P<0.05)(圖1)。

    2.2 Western blot法檢測腸癌患者手術(shù)標本中乙酰化修飾水平

    使用Western blot法檢測腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤腸段組織和同一腸癌患者手術(shù)切除后非腫瘤腸段組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27乙?;竭M行檢測,與正常結(jié)腸上皮組織相比,結(jié)腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平均明顯下調(diào)(均P<0.05)(圖2)。

    3 討 論

    結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,但其發(fā)病機制仍不明確,因腫瘤的早期癥狀不明顯,大部分腫瘤患者確診時已處于中晚期,盡管以根治性切除為主的治療方法已經(jīng)很大程度上延長了患者的生存期,但其晚期轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍然是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因[5]。

    近年來,表觀遺傳學的研究逐漸被認為與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素之一[6],表觀遺傳是指不通過改變DNA序列就能影響基因表達的、可以遺傳的遺傳修飾方式,而組蛋白修飾包括甲基化、乙?;?、磷酸化、泛素化等[7-8],這些修飾的程度與狀態(tài)決定著基因是否表達[7]。有研究[9]發(fā)現(xiàn),組蛋白乙酰化在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的意義,而其中H3K9乙酰化是修飾基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機制。組蛋白乙酰化修飾多在H3賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點和H4精氨酸殘基上的5、8、12、16位點,而這些位點可激活基因也可沉默基因[10-11]。組蛋白乙酰化修飾是通過組蛋白乙?;D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙?;福╤istone deacetylases,HDACs)聯(lián)合調(diào)控,取決于HAT和HDAC的動態(tài)平衡[12]。組蛋白的尾部有多種化學修飾作用,這些修飾可以影響基因的表達(例如:H3和H4發(fā)生乙?;笥欣诩せ罨蜣D(zhuǎn)錄,而H3K9發(fā)生甲基化后可以抑制基因轉(zhuǎn)錄)[13]。組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶的主要功能是對核心組蛋白N端25~40個氨基酸范圍內(nèi)的賴氨酸進行乙?;揎棧琀AT將乙酰輔酶A上的乙?;D(zhuǎn)移到組蛋白N端賴氨酸的ε-氨基上,從而中和了其正電荷,增加了疏水性,削弱了DNA與組蛋白的相互作用,有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,促進轉(zhuǎn)錄[14]。

    近年的研究[15]顯示,腫瘤的發(fā)生不僅與DNA甲基化有關,同樣的,組蛋白乙?;彩菂⑴c其中。有研究[16]發(fā)現(xiàn),組蛋白乙?;毕菰诩毙园籽〉陌l(fā)病中起著重要的作用,也有相關報道[17]證實正常乳腺組織中乙?;慕M蛋白H3、H4的表達均較乳腺癌高。關于組蛋白乙酰化在腸癌中的修飾表達,國外已有相關的報道[18]顯示:組蛋白的異常乙酰化與結(jié)直腸癌的發(fā)病有關。

    本實驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):與NCM460相比,SW480細胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào);與正常結(jié)腸上皮組織相比,結(jié)腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào)。有學者[19]研究證實:在結(jié)直腸癌與其他腫瘤中,組蛋白乙?;档?;然而,對特定部位的檢查表明,乙酰化可以上調(diào)或下調(diào)。而Fraga等[20]使用Western blot分析發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌細胞系H4K16中出現(xiàn)乙?;档停谖捶只Y(jié)腸腺癌中觀察到H4K12和H3K18的低乙?;?,在分化良好的結(jié)直腸腫瘤中,其乙?;揎棾潭仍黾覽21]。與這些發(fā)現(xiàn)相反,H3K9的低乙酰化狀態(tài)與腫瘤組織學類型呈正相關,在分化良好的腫瘤中觀察到H3K9Ac乙?;浇档蚚22]。在其他實體腫瘤中,即肺腺癌和鱗狀細胞癌,H3K27乙酰化的增加在腫瘤部分比在相應的基質(zhì)中更明顯[23]。在前期有關肝癌中組蛋白乙?;揎椝揭渤霈F(xiàn)了類似的變化[24]。因此,后續(xù)的實驗研究將更深入的研究組蛋白乙?;揎椩诮Y(jié)腸癌中體內(nèi)及體外實驗其染色質(zhì)免疫共沉淀等相關實驗,以期組蛋白乙?;揎椩诮Y(jié)腸癌中的機制。

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