來源于嗜熱真菌Talaromyces leycettanus JCM12802 的類膨脹素基因鑒定及功能探究

顧源 尋子琦 鄭菲 涂濤 姚斌 羅會穎

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 國家教育部大豆生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150030）

纖維素是自然界中分布最廣且含量最多的碳水化合物，同時又是數(shù)量最大的可再生資源。目前，利用可再生生物質(zhì)資源生產(chǎn)替代燃料越來越受到人們的重視。但是，纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜［1］，纖維素酶對天然纖維素降解效率比較低，導(dǎo)致工業(yè)化成本很高，從而無法實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。所以，高的水解效率通常需要對底物進行預(yù)處理，一般包括物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物四種預(yù)處理的方式。物理和化學(xué)方法通常會造成一定的環(huán)境污染，同時產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物還會抑制酶的水解活性［2］。而生物預(yù)處理是一種綠色環(huán)保的方法，通過對纖維素晶體結(jié)構(gòu)的疏松和破壞，可以使木質(zhì)纖維素更容易的被纖維素酶水解［3］。研究發(fā)現(xiàn)，一些非水解破壞活性的蛋白能夠促進纖維素酶的水解［4］。這些蛋白與纖維素酶存在協(xié)同作用，包括植物膨脹素［5］，來源于細菌［6］、真菌和線蟲類的類膨脹素蛋白［7-8］，以及一些輔助蛋白如裂解多糖單加氧酶（Lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO）和 Cerato platanin（CP）［9-10］。

膨脹素（expansin）是一類擴展蛋白，能夠破壞并松散植物的細胞壁。膨脹素通過破壞纖維素微纖維間或纖維素和其他細胞壁多糖間的氫鍵來發(fā)揮作用，但對報道的膨脹素一般對它們沒有水解活性［11］，因此可以提高纖維素酶對纖維素類底物的水解［12］。膨脹素的分類是基于其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，根據(jù)文獻報道，有4種膨脹素家族在植物中已經(jīng)被鑒定［13］，分別是α-膨脹素（EXPA）、β-膨脹素（EXPB）、類α-膨脹素（EXLA）、類β-膨脹素（EXLB）。通過實驗證明，EXPA和EXPB能夠使細胞壁松弛［14］，類似膨脹素的蛋白可能在其他的生物體中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，類膨脹素在病原微生物在植物根的定殖［15］及真菌中降解木質(zhì)纖維素等［16］中發(fā)揮作用。非植物的膨脹素蛋白大多屬于類膨脹素家族X（Expansin-like X，EXLX），這些蛋白大多參與細胞壁的延伸過程。目前為止，來源于真菌的里氏木霉（Trichoderma reesei），曲霉屬煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和煙管菌屬煙管菌（Bjerkandera adusta）的TrSwo1，AfSwo1和BaLoosenin，以及細菌河氏菌屬（Hahella chejuensis）的HcEXLX2，細菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的BsEXLX1和線蟲球異皮線蟲屬金線蟲（Globodera rostochiensis）的GrEXPB1都能夠通過破壞纖維素結(jié)構(gòu)來增強纖維素酶的活性［7，17-20］。另外，膨脹素參與細胞壁松弛相關(guān)的其他發(fā)育過程，如果實軟化［21］、花瓣的生長發(fā)育［22］、種子的發(fā)芽［23］、谷物的生長（在早期的生長過程中，膨脹素主要在谷粒皮中被發(fā)現(xiàn)，隨后在胚乳也能發(fā)現(xiàn)，說明膨脹素可能是取決于谷粒最終重量的原因）［24］等過程。

傳統(tǒng)膨脹素的結(jié)構(gòu)包括兩個結(jié)構(gòu)域D1和D2。D1結(jié)構(gòu)域以極性殘基為主，并且與糖苷水解酶GH45酶有較低的相似性，其對于細胞壁的活性是非常重要的。D2結(jié)構(gòu)域是一種非催化模塊，作用類似于碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-binding module，CBM），有助于其結(jié)合纖維素。D2結(jié)構(gòu)域具有扁平的芳香族氨基酸殘基，可以與糖環(huán)的疏水中心相互作用［25］。

真菌來源的swollenin通常包括3個結(jié)構(gòu)域：N端的信號肽和一個典型的真菌類型的CBM區(qū)，一個結(jié)構(gòu)與GH45相似的同源區(qū)以及一個與膨脹素類似的區(qū)域。植物膨脹素通常不大于250個氨基酸殘基，而真菌中的swollenin是這種尺寸的2倍。該大小的差異進一步支持細菌和真菌膨脹素相關(guān)蛋白的進化通過水平基因轉(zhuǎn)移和獨立結(jié)構(gòu)域融合事件發(fā)生的假設(shè)［26］。此外，swollenin顯示出與植物擴展蛋白不同的獨特作用模式，但其類似于內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的作用，但其不適合任何標(biāo)準(zhǔn)的纖維素酶類［27］。

在本研究中，我們從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802中克隆得到了一個新的類膨脹素基因Tlexlx1，并構(gòu)建了CBM融合基因CBM-Tlexlx1，類膨脹素基因及其融合基因在畢赤酵母中實現(xiàn)了表達，并對其基本性質(zhì)進行研究，為在生物工程等高新技術(shù)領(lǐng)域中解決現(xiàn)代纖維素利用率低，難降解等的問題上提供了新的思路，以及對于非植物來源的類膨脹素EXLX家族的基因功能的鑒定提供新的素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802 購自日本微生物菌種保藏中心（Japan collection of microorganisms，JCM）；畢赤酵母Pichia pastorisGS115 和質(zhì)粒pPIC9購自Thermo Fisher（原Invitrogen）；克隆菌株Escherichia coliTrans-T1和質(zhì)粒pEASY-T3 購自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體及固體培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基的配制見《分子克隆實驗指南》（J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著），MD固體培養(yǎng)基、MM固體培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基按照Invitrogen公司發(fā)布的畢赤酵母表達系統(tǒng)操作手冊配方配制。

1.1.3 試劑 真菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；真菌RNA 提取試劑盒購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TOYOBO購自Tokyo公司；蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad公司；限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購買自New England Biolab公司；FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金公司，蛋白Marker夠買于北京GeneStar生物公司。商品纖維素酶購自Sigma公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 類膨脹素基因Tlexlx1的克隆及融合基因CBM-Tlexlx1的構(gòu)建 嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802的全基因組序列已由上海美吉公司完成測序。經(jīng)過對注釋序列進行分析，Tlexlx1是一個典型的類膨脹素基因。通過美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLAST模 塊（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/） 對該基因的新穎性進行評估，利用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù) 測 其 信號肽序列。利用Vector NTI Advance 10.0軟件分析Tlexlx1基因序列及編碼蛋白理論蛋白分子量大小、等電點。利用ClustalW軟件和ESPript 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行多序列比對分析。

為了獲得類膨脹素基因Tlexlx1的cDNA序列，將T. leycettanusJCM12802接種于PDB培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d后，以2%接種量轉(zhuǎn)接于以復(fù)合培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)3 d。用干凈濾紙過濾菌液得到菌體后，置于液氮中用研缽充分研磨，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TOYOBO（Tokyo，Japan）合成cDNA單鏈。并以cDNA為模板，用特異性引物Tlexlx1-F（5′-CGG AATTCGGGCCTCTTGTTGGACGTCAGGA-3′，下劃線為EcoRΙ酶切位點）和Tlexlx1-R（5′-TTGCGGCCGC CTAAAAGTTTGAAGACGCAGTCGTGGT-3′，下劃線為NotI的酶切位點）進行PCR擴增，擴增后將得到符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物連接至pEASY-T3載體上，并轉(zhuǎn)化Trans-T1菌株，陽性克隆進行測序驗證。

將同樣來源的膨脹素基因的CBM區(qū)編碼序列Tlswo-CBM用overlap PCR的方法融合到Tlexlx1的N端，構(gòu)建了融合基因CBM-Tlexlx1。第一輪PCR使用引物CBMF（CGGAATTCCAGAGCAGCTGTGCAGGGACC，下劃線為EcoRΙ酶切位點）和Tlexlx1-CBM-R1（TCCAACAAGAGGCCCCATGGTTCCGGATT TGCACATGGAC）擴增得到CBM區(qū)編碼序列，使用引物Tlexlx1-CBM-F1（5′-AAATCCGGAACCATGGGG CCTCTTGTTGGACGTCAG-3′）和Tlexlx1-R擴增等到Tlexlx1編碼序列。第二輪PCR將第一輪PCR產(chǎn)物混合后作為模板，使用引物CBMF和Tlexlx1-R擴增等到CBM和Tlexlx1的融合編碼基因CBM-Tlexlx1。

1.2.2 畢赤酵母表達重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對測序正確的Tlexlx1基因和CBM融合基因CBM-Tlexlx1以及酵母表達載體pPIC9進行雙酶切，將正確的目的片段與載體回收，用T4DNA連接酶室溫下連接2 h，轉(zhuǎn)入E. coli TransI-T1感受態(tài)細胞中，37℃孵育30-60 min，涂于具有氨芐抗性的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落并進行陽性克隆的篩選。經(jīng)測序正確后得到重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1。

1.2.3 重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1在畢赤酵母中的表達與純化 將重組質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1通過BglII單酶切進行線性化，線性化產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)細胞中，涂至MD平板上，30℃培養(yǎng)2-3 d待菌落長出。然后，從MD板上挑取96個單克隆子到帶有1-96編號MD平板，培養(yǎng)1-2 d。按編號挑取MD平板上正常生長轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的15 mL離心管中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，離心去上清，更換為含有0.5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d，然后離心取上清用于酶活性檢測。篩選出酶活相對較高，蛋白量相對較大的轉(zhuǎn)化子進行搖瓶的放大培養(yǎng)。酶活高的轉(zhuǎn)化子接入YPD培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d，然后按1%接種量接種于400 mL BMGY培養(yǎng)基30℃、260 r/min搖床中培養(yǎng)2 d，離心去上清，用200 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d（中間補加甲醇一次）。將酶液在12 000 r/min下離心10 min，收集上清液進行酶活的測定及蛋白電泳（SDS-PAGE）分析。

用10 kD的膜包對上清的粗酶液進行濃縮同時去除小分子等雜質(zhì)并更換緩沖液。濃縮后的酶液用Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）過夜透析（3 kD透析袋）進行脫鹽處理。經(jīng)過處理后的低鹽濃度的酶液，使用HiTrap Q XL陰離子柱進行純化，用1 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，收集洗脫峰并進行酶活力測定。SDS-PAGE電泳檢測并分析其純度，純化后的酶液進行酶的性質(zhì)分析。并且對表達的蛋白進行質(zhì)譜鑒定，樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂所測定。

1.2.4 酶活測定方法 本實驗采取DNS法測定類膨脹素TlEXLX1的活性。底物：大麥葡聚糖、地衣多糖或CMC-Na（900 μL），緩沖液：檸檬酸-磷酸二氫鈉（終濃度為0.1 mol/L），稀釋酶液100 μL，終止劑DNS（1.5 mL，煮沸5 min），OD540下讀取吸光值。

酶活定義：最適反應(yīng)條件下，每分鐘分解底物生成1 μmoL葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位U。

1.2.5 蛋白定量 用蛋白定量試劑盒對TlEXLX1和CBM-TlEXLX1進行蛋白定量。將不同濃度的蛋白標(biāo)品（BSA）和待測樣品TlEXLX1、CBM-TlEXLX1、加入在酶標(biāo)條中，然后加入200 μL考馬斯亮藍顯色劑。室溫反應(yīng)8 min后，在波長（OD595）處讀取吸光值。根據(jù)所測得的吸光值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算出樣品的蛋白質(zhì)含量（mg/mL）。

1.2.6 類膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1基本酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.2.6.1 最適pH的測定 將純化后TlEXLX1和CBM-TlEXLX1，加入到不同pH（pH 2.2-12.0）100mmol/L的緩沖液（pH 2.2-8：檸檬酸-磷酸氫二鈉；pH 8-9：Tris-HCl；pH10-12：Gly-NaOH）的底物中，在60℃下反應(yīng)10 min，測定其最適pH。每個反應(yīng)3個平行及一個空白對照，根據(jù)測定結(jié)果繪制最適pH曲線。

1.2.6.2 最適溫度的測定 用pH 6.0的緩沖液把酶液稀釋合適的倍數(shù)，在不同溫度（30-70℃）下反應(yīng)10 min測定其最適溫度，每個反應(yīng)3個平行及一個空白對照，根據(jù)測定結(jié)果繪制最適溫度曲線。

1.2.6.3 類膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1比活力及底物特異性的測定 選取地衣多糖（1%），大麥葡聚糖（1%）、昆布多糖（1%）、CMC-Na（2%）、微晶纖維素（1% Avicel）、葡甘露聚糖（1%）、角豆膠（1%）、木聚糖（1%）和瓜爾豆膠（1%）作為底物，pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度100 mmol/L）緩沖液配置。通過DNS法測定TlEXLX1和CBMTlEXLX1的比活力。

比活力單位定義為，每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。（1%為質(zhì)量體積比）。

1.2.7TlEXLX1及 CBM-TlEXLX1與纖維素酶的協(xié)同實驗 采用兩步法進行TlEXLX1與纖維素酶的協(xié)同實驗。以10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）作為底物，pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度50mmol/L）緩沖液，體系1 mL。過程：取TlEXLX1 0 μg、1 μg、5 μg、10 μg、20 μg 和 30 μg 分別用緩沖液稀釋到 100 μL，加入用900 μL 10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）底物中進行預(yù)處理，放入金屬?。ń饘僭〉淖饔檬悄軌蚴刮⒕Юw維素反應(yīng)充分）37℃下振蕩24 h（600 r/min），取出樣品90℃下滅活10 min，離心（12 000 r/min），用緩沖液洗3-4遍初去殘留TlEXLX1或CBM-TlEXLX1，分別加入100 μL（0.3 U）的商品纖維素酶，buffer補齊到1 mL，0、30、60和90 min分別取樣120 μL測定酶活。用DNS法進行測定釋放還原糖的量。

用10 mg/mL的微晶纖維素（Avicel）作為底物，pH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉（終濃度50 mmol/L）緩沖液，體系1 mL。過程：加入100 μL的TlEXLX1及 CBM-TlEXLX1（10 μg）對底物（900 μL）進行預(yù)處理，放入金屬浴37℃下振蕩24 h（600 r/min），取出90℃下滅活10 min，離心（12 000 r/min），用緩沖液洗3-4遍去除TlEXLX1和CBM-TlEXLX1。隨后，加入100 μL（0.3 U和0.6 U）的商品纖維素酶，buffer補齊到1 mL，每30 min取樣120 μL測定酶活。用DNS法進行測定酶活力。

按照上述方法，測定（1 U，2 U）的商品纖維酶與類膨脹素TlEXLX1（10 μg）時的協(xié)同作用。過程同上。上述實驗均用金屬浴與完成。

1.2.8 重組酶TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理微晶纖維素的掃描電鏡實驗 用TlEXLX1和CBMTlEXLX1各 300 μg加 入 到 微 晶 纖 維 素（5 mg/mLAvicel）和濾紙（5 mg/mL）的底物中用pH 6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（終濃度50 mmol/L）將體系補齊到1 mL，37℃下輕微震蕩處理24 h，然后烘干被處理過的底物。分別用Buffer和BSA代替膨脹素作為對照實驗。

掃描電鏡觀察實驗前，需對樣品進行處理，在樣品上粘上少量的導(dǎo)電膠，用棉簽粘取少量干燥的固體樣品微晶纖維素和濾紙后涂貼在導(dǎo)電膠上，然后去除多余未粘在導(dǎo)電膠上的粉末，進行噴金處理30 min后，進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 TlEXLX1基因的克隆及序列分析

T. leycettanusJCM12802類膨脹素基因Tlexlx1基因全長為1 196 bp，含有1個內(nèi)含子（83 bp）。cDNA全長為1 113 bp，編碼370個氨基酸和一個終止密碼子。SignalP預(yù)測N-端前22個氨基酸為信號肽。用NetNGlyc 1.0 Server對TlEXLX1進行N-糖基化預(yù)測，沒有N-糖基化位點，融合蛋白CBMTlEXLX1有兩個N-糖基化位點。Tlexlx1編碼蛋白TlEXLX1的理論蛋白分子量大小為35.4 kD，等電點為4.3，而CBM-Tlexlx1的理論分子量為51.5 kD，等電點為4.3。

根據(jù)BlastP比對結(jié)果顯示Tlexlx1編碼蛋白與Penicilliopsis zonataCBS 506.65來源的假想蛋白hypothetical protein ASPZODRAFT_140583具有最高的序列相似性為81%，與Penicillium digitatumPd1來源的Expansin-like protein 1序列相似性為56%?；騎lexlx1提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，序列注冊號為 MH036891。

2.2 表達載體pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1的構(gòu)建與重組蛋白的表達與純化分析

將不含有自身信號肽的Tlexlx1和CBM-Tlexlx1c-DNA序列，以正確的閱讀框克隆到質(zhì)粒pPIC9上信號肽編碼序列α因子后，得到重組表達質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBM-Tlexlx1，測序結(jié)果表明構(gòu)建成功。

對重組表達質(zhì)粒pPIC9/Tlexlx1和pPIC9/CBMTlexlx1轉(zhuǎn)化畢赤酵母的克隆子通過酶活力測定及蛋白電泳檢測進行篩選，成功選到了陽性克隆子。將陽性克隆子通過搖瓶水平發(fā)酵，獲得發(fā)酵上清液。通過濃縮和純化得到并收集得到了純化的蛋白。純化后的蛋白進行蛋白電泳檢測，根據(jù)蛋白電泳結(jié)果（圖1）可知，重組蛋白TlEXLX1（泳道1）表觀分子量為75 kD，比理論分子量大（TlEXLX1理論分子量為35.4 kD）。融合蛋白CBM-TlEXLX1（泳道2）在75 kD和180 kD處均可發(fā)現(xiàn)明顯條帶，均比理論分子量大（融合蛋白CBM-TlEXLX1的理論分子量為 51.5 kD）。

圖1 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1的SDS-PAGE圖

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，重組蛋白測定結(jié)果能夠與理論蛋白序列匹配，覆蓋上的肽段為：GPSGNSIK和NKDGTSAYWFSMQVVNANEPVASLEVSTDGGST WQSTTRTYYNYFEKQSGFGTDTVDVRITSTSGATIT VK）。

分子量75 kD（180 kD）融合蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果與理論蛋白序列也都能匹配，覆蓋上的肽段分別為：SGTMGPLVGR，GPSGNSIK和 NKDGTSAYWFS MQVVNANEPVASLEVSTDGGSTWQSTTRTYYNYFEK QSGFGTDTVDVRITSTSGATITVKNVSCQSESTTTASS NF（SGTMGPLVGR，GPSGNSIK和NKDGTSAYWFS MQVVNANEPVASLEVSTDGGSTWQSTTRTYYNYFEK QSGFGTDTVDVRITSTSGATITVK）。

在分子量75 kD和180 kD融合蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，野生型N-端的部分序列和CBM（TlSWO1）末端的部分序列連接成一條肽段（SGTMGPLVGR，下劃線部分屬于CBM序列，無下劃線屬于野生型序列）。質(zhì)譜結(jié)果說明，該蛋白是正確表達的TlEXLX1類膨脹素蛋白，同時也確定融合蛋白構(gòu)建成功。

通過N-糖基化預(yù)測，結(jié)果可知重組蛋白沒有N-糖基化位點，而融合蛋白存在兩個N-糖基化位點。而通過對重組蛋白和融合蛋白進行O-糖基化預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在氧糖基化位點。所以，推測蛋白分子量變大很大程度上受到氧糖基化的影響。

2.3 類膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1酶學(xué)性質(zhì)測定

2.3.1 類膨脹素TlEXLX1和CBM-TlEXLX1最適溫度和最適pH 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBMTlEXLX1的最適溫度均為60℃（圖2-A），最適pH均為6.0（圖2-B）。重組酶TlEXLX1在50ü和70℃下均有90%以上的酶活，而突變體CBM-TlEXLX1在在50℃和70℃下都保持著80%以上的酶活。在pH在4.0-7.0條件下，均能保持85%以上的酶活性。

2.3.2 重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1協(xié)同實驗的測定 實驗結(jié)果（圖3-A）可以看出，在所選擇TlEXLX1的濃度范圍內(nèi)，協(xié)同效果沒有明顯差異，10 μg，20 μg的效果相對較好，在 90 min時，分別產(chǎn)生了1.26和1.17 mmol/L的還原糖。

圖2 溫度和pH值對兩種蛋白催化活性的影響

接下來選擇10 μg的TlEXLX1和CBM-TlEXLX1與 0.3 U，0.6 U的商品纖維素酶協(xié)同。結(jié)果加入0.6 U的纖維素酶比加入0.3 U的協(xié)同效果明顯。在經(jīng)過TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理后，加入纖維素酶量為0.3 U時，在150 min時分別產(chǎn)生2.49 mmol/L和2.46 mmol/L的還原糖，略高于沒經(jīng)過膨脹素處理的直接添加0.3 U纖維素酶所產(chǎn)生的2.29 mmol/L的還原糖。而經(jīng)過TlEXLX1和CBM-TlEXLX1處理后，加入纖維素酶量為0.6 U時，在60 min時分別產(chǎn)生3.06 mmol/L和3.03 mmol/L的還原糖，高于對照直接添加0.6 U纖維素酶產(chǎn)生的2.49 mmol/L的還原糖（圖3-B，C）。

而選擇10 μg的TlEXLX1與 1 U，2 U的商品纖維素酶協(xié)同，由實驗結(jié)果可知，加入1 U，2 U的商品纖維素酶在1 h內(nèi)幾乎都沒有產(chǎn)生協(xié)同效果。在60 min時，1 U纖維素酶產(chǎn)生了7.38 mmol/L還原糖，略低于空白產(chǎn)生的8.18 mmol/L還原糖。在反應(yīng)40 min后，加入2 U的纖維素酶產(chǎn)生7.12 mmol/L幾乎等于空白產(chǎn)生的7.14 mmol/L還原糖（圖3-D，E）。

2.3.3TlEXLX1和CBM -TlEXLX1底物特異性及比活力測定TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對地衣多糖有最高的水解活力，比活分別為7.2 U/mg 和17.2U/mg。其次是大麥葡聚糖和昆布多糖，TlEXLX1的比活力為4.4 U/mg、1.6 U/mg，CBM-TlEXLX1對大麥葡聚糖和昆布多糖的比活力為9.4 U/mg、3.7 U/mg。TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對CMC-Na、微晶纖維素、葡甘露聚糖等有微弱的活性。突變體相對于野生型對以上3種底物的比活分別提高了2.4倍、2.1倍和2.3倍?？梢?，CBM區(qū)能有效提高類膨脹素對底物的水解能力。

圖3 TlEXLX1和CBM-TlEXLX1與商品纖維素酶協(xié)同效果

2.4 TlEXLX1和CBM-TlEXLX1掃描電鏡實驗

從掃描電鏡的結(jié)果可以看到，未經(jīng)處理的微晶纖維素和濾紙表面很光滑并且很致密，結(jié)構(gòu)性很強。經(jīng)過重組蛋白TlEXLX1和融合蛋白CBM-TlEXLX1處理過的微晶纖維素（圖4-A-D）和濾紙（圖4-E-H），其表面明顯被破壞，變的粗糙，致密的纖維素結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂，有明顯被腐蝕的痕跡。說明了TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對濾紙和微晶纖維素致密的結(jié)構(gòu)造成了一定的破壞作用，從而推測更有利于與纖維酶的協(xié)同。

3 討論

真菌來源的類膨脹素主要是swollenin，細菌來源的有EXLX和swollenin［28］。來源于不同家族膨脹素蛋白的氨基酸序列有著明顯不同，相似性只有20%-40%［29］。本實驗從嗜熱真菌克隆到的類膨脹素基因Tlexlx1與P. digitatumPd1 來源的Expansinlike protein 1相似性僅為56%，而與有晶體結(jié)構(gòu)報道的膨脹蛋白（PDB編號4JVC）只有30%的最高序列相似性。到目前為止，關(guān)于來源于真菌類膨脹素EXLX家族基因的相關(guān)報道還很少見，因此可以作為研究EXLX類膨脹素的新穎性材料。通過多序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因具有典型膨脹素的結(jié)構(gòu)特點［13-14］，但是其N端有一段未知區(qū)域，這與大多數(shù)真菌來源的類膨脹素有著明顯不同。Swollenin的N端存在一個非常保守的CBM 區(qū)，CBM區(qū)通常有利于swollenin蛋白更好的結(jié)合到纖維素底物上［16］，而在Tlexlx1基因中有一段未知結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域而缺少類似CBM區(qū)。該段未知區(qū)域的功能我們將在今后的工作中繼續(xù)研究。我們將swollenin的N端 CBM區(qū)與Tlexlx1的N端融合發(fā)現(xiàn)，融合蛋白CBM-TlEXLX1相對于野生型TlEXLX1對葡聚糖酶等底物的水解活力提高了2-2.4倍。因此，可以推斷CBM的加入能更好的的結(jié)合底物并充分發(fā)揮水解功能。

在已報道的4類膨脹素EXPA、EXPB、EXLA和 EXLB中，多數(shù)EXPA 和 EXPB家族的成員在體外都具有膨脹素活性，EXLA 和 EXLB雖然具有典型的膨脹素的結(jié)構(gòu)（包含兩個結(jié)構(gòu)域），其成員還沒有發(fā)現(xiàn)有類似膨脹素的活性［30］。本實驗從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802成功克隆到了一個類膨脹素基因Tlexlx1，成功在畢赤酵母中進行了表達，純化的重組酶具有水解葡聚糖底物的活力，及微弱的濾紙和微晶纖維素的水解活力。在大多數(shù)報道的膨脹素文獻中，均沒有發(fā)現(xiàn)水解活性。例如，來源于Trichoderma harzianum（ThSwo）［31］，Trichoderma reesei（TrSwo1），Bacillus subtilis（BsEXLX1）［28］以及來源于白腐真菌裂褶菌屬（ScExlx1）［32］。

類膨脹素TlEXLX1和商品纖維素酶混合反應(yīng)表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。通過兩步法用TlEXLX1對微晶纖維素先進行處理，然后再用纖維素酶處理，發(fā)現(xiàn)能夠提高纖維酶水解作用，也證明存在協(xié)同作用。根據(jù)報道，兩步法能夠克服酶對纖維素樣本的競爭，并且通過洗脫被膨脹素處理的底物，能夠得更多利于纖維素酶結(jié)合的位點。類膨脹素蛋白能夠與纖維素進行可逆的結(jié)合，因此兩步法不僅能夠更有利于酶與底物的結(jié)合，同時還能釋放更多的結(jié)合位點［33］。經(jīng)過預(yù)處理后再用纖維素酶水解比膨脹素和纖維素酶同時反應(yīng)水解效應(yīng)增強［6］。掃描電鏡的實驗也證實了類膨脹素TlEXLX1對微晶纖維素和濾紙有一定松散和破壞作用。之前的文獻也報道了類膨脹素swollenin也具有類似的作用效果［31］。

報道稱植物膨脹素在異源系統(tǒng)中以活性的形式表達是非常困難的［24］，本研究通過異源表達，獲得了真菌來源的與植物膨脹素類似作用的蛋白。同時TlEXLX1還具有水解活性，為膨脹素的研究開辟了新的途徑，也為 EXLX支架蛋白的分子工程開辟了道路，以闡明蛋白活性的結(jié)構(gòu)需求。TlEXLX1還能夠與纖維素酶協(xié)同配合將木質(zhì)纖維素有效轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的糖，提高其水解效率，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。今后我們將從蛋白結(jié)構(gòu)、分子進化、作用機制等都方面對其進行深入的研究。

4 結(jié)論

本實驗從嗜熱真菌T. leycettanusJCM12802中成功克隆得到一個類膨脹素基因Tlexlx1，并成功構(gòu)建融合基因CBM-Tlexlx1。TlEXLX1和CBM-TlEXLX1成功在畢赤酵母中表達，并對其進行性質(zhì)測定。

TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對地衣多糖有最高的水解活力，比活分別為7.2 U/ mg 和17.2 U/mg，對CMC-Na和微晶纖維素均有微弱的水解活性，以地衣多糖為底物的最適pH和最適溫度均為6.0和60℃。類膨脹素與商品纖維素酶有一定的協(xié)同作用，使用10 μg類膨脹素TlEXLX1和0.6 U商品纖維素酶處理微晶纖維素，協(xié)同效果最好。

通過掃描電鏡觀察，TlEXLX1和CBM-TlEXLX1對微晶纖維素和濾紙的表面有破壞作用。綜上，該真菌來源的類膨脹素TlEXLX1（expansin）有很好的新穎性并在協(xié)同降解纖維素上有潛在的應(yīng)用價值。