橡膠樹膠孢炭疽菌NADPH氧化酶功能研究

郭云峰 安邦

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，?？?570228）

橡膠樹炭疽病害是海南省橡膠園區(qū)主要的真菌病害之一，主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。該病原菌能夠侵染橡膠樹葉片、葉柄及果實，引起橡膠樹嫩梢回枯及重復(fù)落葉，推遲開割時間，從而影響膠乳產(chǎn)量［1-2］。目前對于該病害的防治主要依靠噴施化學(xué)農(nóng)藥，雖然短期內(nèi)效果顯著，但是容易對環(huán)境造成污染，也會引起病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，從分子水平上研究膠孢炭疽菌的致病機制，有助于新型農(nóng)藥的開發(fā)。

煙酰胺腺嘌呤二核磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（Nox）是一類定位于細胞膜上的特殊蛋白，它們是真核生物細胞內(nèi)氧化還原信號的關(guān)鍵酶，也是細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要來源。在動物細胞中，Nox通過控制細胞內(nèi)ROS水平，參與調(diào)控機體免疫反應(yīng)及一系列生理功能［3］。在植物細胞中，Nox參與調(diào)控植物生長發(fā)育及生物或非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)［4］。近年來，研究者們在真菌中也發(fā)現(xiàn)了一系列Nox蛋白，它們在真菌的生長和分化過程中起著重要作用［5］。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中，NoxA與子實體的形成密切相關(guān)［6］。進一步研究表明，NoxA主要通過調(diào)控構(gòu)巢曲霉菌絲尖端ROS的代謝來維持菌絲的頂端優(yōu)勢［7］。在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中，Nox1的缺失會導(dǎo)致雌性不育、降低分生孢子的形成、并且降低菌絲生長的速度；而Nox2的缺失會導(dǎo)致接合孢子失去萌發(fā)能力［8］。此外，在病原真菌中，Nox也與病原真菌對寄主的致病力有著密切關(guān)系。在稻瘟菌中，Nox與附著胞侵入水稻葉片的能力密切相關(guān)［9］。在腐生型植物病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）中，Nox與灰霉菌的生長發(fā)育以及致病力密切相關(guān)［10］。在人體病原菌白色念珠菌（Candida albicans）中，Nox參與調(diào)控病原菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變及對寄主的致病力［11］。

通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，在橡膠樹膠孢炭疽菌基因組中存在著3個編碼Nox蛋白的基因，分別命名為CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC。此外，在基因組中還存在一個編碼Nox調(diào)節(jié)蛋白的基因，命名為CgNoxR。至今為止，尚未有關(guān)橡膠樹膠孢炭疽菌Nox功能的研究報道。在本研究中，通過構(gòu)建這4個基因的敲除突變株及對敲除突變株的生理表型的分析，初步闡明了Nox在膠孢炭疽菌中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 橡膠樹膠孢炭疽菌野生型菌株由本實驗室分離保存，并在前期工作中完成該菌株的基因組測序工作。

1.1.2 實驗試劑 實驗所用基因敲除載體pBS-SUR由本實驗室改造，以pBluescript II KS（+）為骨架，在PstI，EcoRI位點處連入氯嘧磺隆抗性基因（稻瘟菌乙酰乳酸合成酶基因，SUR）。PCR引物合成及DNA測序由華大基因公司完成，DNA聚合酶、DNA Marker及大腸桿菌感受態(tài)均購自北京全式金公司，限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，羧芐青霉素、卡那霉素、氯嘧磺隆均購自Sigma公司，裂解酶（Lysing enzyme）及聚乙二醇（PEG 3350）購自Sigma公司，其它化學(xué)試劑采用國產(chǎn)分析純。采用土豆浸膏培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基（CM）及麥芽提取物培養(yǎng)基（MEA）培養(yǎng)菌株。采用再生培養(yǎng)基（含1 g/L 酵母浸粉，1 g/L酸水解酪蛋白以及6 mol/L蔗糖）培養(yǎng)真菌原生質(zhì)體。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹膠孢炭疽菌Nox預(yù)測 應(yīng)用BioEdit軟件，以膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides strain Nara gc5的Nox蛋白序列為模板，在本實驗室測序拼接的橡膠樹膠孢炭疽菌基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blast-P，檢索同源序列。

1.2.2 敲除載體的構(gòu)建 本實驗中采用同源重組原理進行目的基因的敲除，具體策略如圖1所示：以野生型菌株基因組DNA為模板，分別擴增待敲除基因序列的上下游片段，作為同源重組所需的同源臂；經(jīng)測序分析正確后，將上下游片段分別用對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（表1）進行雙酶切，并依次連入敲除載體pBS-SUR的SUR基因的左右兩側(cè)，完成敲除載體的構(gòu)建。之后以敲除載體為模板，利用上游同源臂的正向引物及下游同源臂的反向引物，用高保真酶擴增基因敲除所需的DNA片段，回收備用。

1.2.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 橡膠樹膠孢炭疽菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化參照文獻［12］所述方法進行。將野生型菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，并使用無菌濾膜除去菌絲體。再將孢懸液接種于200 mL液體完全培養(yǎng)基中，使得孢子初始濃度為105個/mL，將孢子在28℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)14-16 h。采用無菌濾膜收集菌絲體，并將菌絲體轉(zhuǎn)移到含10 mg/mL裂解酶的1 mol/L山梨醇緩沖液中，在28℃，100 r/min培養(yǎng)3 h以降解菌絲體細胞壁。然后在冰浴條件下，使用無菌濾膜過濾收集原生質(zhì)體，在4℃、2 000 ×g條件下離心10 min收集原生質(zhì)體，并用冰冷的1 mol/L山梨醇緩沖液沖洗2次除去殘余酶液。最后，用山梨醇緩沖液將原生質(zhì)體濃度調(diào)整至108個/mL。在上述制備好的200 μL原生質(zhì)體中，加入100 μL重組DNA片段，緩慢吸打混勻，于冰上放置20 min。然后在混合物中緩慢加入1 mL含40% PEG的山梨醇緩沖液，并顛倒混勻，于28℃放置20 min。待轉(zhuǎn)化完成后，在轉(zhuǎn)化混合物中加入5 mL液體再生培養(yǎng)基，在28℃，100 r/min再生培養(yǎng)4 h。之后在培養(yǎng)物中加入處于熔化狀態(tài)、溫度在50℃左右、含1%瓊脂的固體再生培養(yǎng)基，顛倒混勻后平鋪于培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，再在其上平鋪含100 μg/mL氯嘧磺隆的固體再生培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)3-4 d。

圖1 敲除原理圖

1.2.4 敲除突變株的鑒定 本實驗中采用氯嘧磺隆篩選轉(zhuǎn)化子。待轉(zhuǎn)化、再生培養(yǎng)后，將陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，并提取其基因組DNA進行PCR鑒定。為了檢測基因敲除片段是否正確重組到目標(biāo)基因位點，本實驗中采用兩輪PCR檢測方法鑒定轉(zhuǎn)化子，具體策略如圖1所示：在重組片段中的上游同源臂的外側(cè)及抗性基因SUR序列中設(shè)計一對檢測引物；同理，再在下游同源臂的外側(cè)及抗性基因SUR序列中設(shè)計一對檢測引物；通過PCR擴增檢測重組片段是否正確整合到目標(biāo)基因的位點。獲得正確的敲除突變株后，通過單孢分離對篩選到的突變株進行分離純化。將檢測正確的突變體菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，使用無菌濾膜除去菌絲體，計算孢子濃度，配置成濃度為103個/mL的孢懸液，并取100 μL均勻涂布在含100 μg/mL氯嘧磺隆的MEA平板上，放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌落后，提取其基因組DNA進行檢測。

1.2.5 產(chǎn)孢量檢測及孢子形態(tài)觀察 將野生型菌株與4種敲除突變株分別接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。然后使用無菌水收集分生孢子，并使用無菌濾膜除去菌絲體。然后使用血球計數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下計算孢子濃度，接種于30 mL的液體完全培養(yǎng)基之中，使得孢子初始濃度為103個/mL。將菌株置于28℃，160 r/min震蕩培養(yǎng)3 d之后，統(tǒng)計孢子濃度［9］。取上述重懸于新鮮完全培養(yǎng)基中的孢子懸浮液，滴加在干凈的載玻片上，于28℃、濕潤環(huán)境下培養(yǎng)6 h，利用顯微鏡定時觀察孢子形態(tài)。

1.2.6 致病力分析 采集生長正常、沒有損傷的嫩綠期的橡膠樹葉片用于致病力分析。如上所述，收集不同菌株的分生孢子，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸，制備成濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液。之后在葉片上滴加5 μL孢子懸浮液，并將接種后的離體葉片置于光照培養(yǎng)箱中，28℃、濕潤環(huán)境下培養(yǎng)5 d，觀察葉片發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率，記錄葉片病斑直徑。每個處理共包含30片葉片，分為3組。本實驗共重復(fù)兩次。

1.2.7 菌絲尖端活性氧代謝檢測 如上所述，收集不同菌株的分生孢子，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸，制備成濃度為2×105個/mL的孢子懸浮液備用。將無菌玻璃紙覆于PDA培養(yǎng)基上，并在玻璃紙上滴加孢子懸浮液，于28℃、濕潤環(huán)境下培養(yǎng)12 h。之后將玻璃紙及玻璃紙上的菌絲體轉(zhuǎn)移到載玻片上，并在菌絲體上滴加約50 μL的0.4%硝基藍四氮唑（Nitroblue tetrazolium，NBT）染液。染色10 min后，使用蒸餾水漂洗，于顯微鏡下觀察并記錄。

表1 本實驗所用引物。

2 結(jié)果

2.1 橡膠樹膠孢炭疽菌Nox基因信息

通過與基因組進行比對，分別搜索到3個Nox同源蛋白，分別命名為CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC。此外，在基因組中檢索到一個編碼Nox調(diào)節(jié)蛋白（NoxR）的基因，命名為CgNoxR。這4個蛋白及其編碼基因的具體信息如表2所示。

表2 橡膠樹膠孢炭疽菌中Nox基因及其編碼蛋白的信息

2.2 敲除突變株的鑒定

利用同源重組原理，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法分別獲得了多個具有氯嘧磺隆抗性的陽性轉(zhuǎn)化子。利用PCR擴增檢測各轉(zhuǎn)化子，結(jié)果如圖2所示。CgNoxA敲除轉(zhuǎn)化子成功擴增出約1 393 bp、1 741 bp大小的目標(biāo)條帶；CgNoxB敲除轉(zhuǎn)化子成功擴增出約1 885 bp、1 497 bp大小的目標(biāo)條帶；CgNoxC敲除轉(zhuǎn)化子成功擴增出約1 666 bp、1 630 bp bp大小的目標(biāo)條帶；CgNoxR敲除轉(zhuǎn)化子成功擴增出約1 863 bp、1 593 bp大小的目標(biāo)條帶。經(jīng)測序分析，表明擴增的條帶為目標(biāo)條帶，表明基因敲除片段成功整合到目標(biāo)基因的位點，敲除突變株構(gòu)建成功。

進一步通過單孢分離，獲得了4個基因的敲除突變株純合體菌株。將這4個敲除突變株分別命名為ΔCgNoxA、ΔCgNoxB、ΔCgNoxC和ΔCgNoxR。

圖2 敲除突變株的PCR鑒定

2.3 突變株產(chǎn)孢量檢測

在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，統(tǒng)計不同菌株培養(yǎng)物中孢子濃度。結(jié)果如表3所示，在培養(yǎng)3 d后，野生型菌株培養(yǎng)物中孢子濃度約為21×105個/mL；在4個敲除突變株中，ΔCgNoxA的孢子濃度僅為1.1×105個/mL，遠遠低于野生型菌株；ΔCgNoxB的孢子濃度僅為116×105個/mL，孢子產(chǎn)量提高了約5倍；ΔCgNoxB和ΔCgNoxR的產(chǎn)孢量與野生型菌株相比略有下降，分別為15×105個/mL及8.6×105個/mL。

表3 突變株產(chǎn)孢量檢測結(jié)果

2.4 突變株孢子形態(tài)及萌發(fā)過程觀察

將4個基因的敲除突變株及野生型菌株的孢子進行培養(yǎng)，并對其孢子形態(tài)及萌發(fā)過程進行觀察。結(jié)果（圖3）表明，4種突變株的孢子形態(tài)與野生型菌株相比沒有明顯差異，但是ΔCgNoxR突變株的孢子萌發(fā)過程明顯異常，其孢子芽管長度明顯短于其它菌株，且芽管形態(tài)發(fā)生變異。

2.5 突變株致病力分析

將4個基因的敲除突變株與野生型菌株同時接種橡膠樹葉片，結(jié)果（圖4-A）發(fā)現(xiàn)，在接種3 d后，與野生型菌株相比，ΔCgNoxB的發(fā)病率明顯下降，約為25%；ΔCgNoxA和ΔCgNoxR的發(fā)病率也有不同程度的下降（圖4-B）。此外，ΔCgNoxB侵染葉片后產(chǎn)生的病斑直徑明顯小于野生型菌株；ΔCgNoxA和ΔCgNoxR產(chǎn)生的病斑直徑出現(xiàn)了一定下降（圖4-C）。

圖3 野生型與4種突變體孢子形態(tài)與菌絲差異

2.6 活性氧代謝檢測

為了檢測菌絲尖端活性氧代謝情況，本實驗中采用硝基四氮唑染色法對各菌株進行了檢測。如圖5所示，在染色10 min后，野生型菌株的菌絲尖端產(chǎn)生了密集的甲月替（Formazan）沉淀，說明在野生型菌絲尖端存在著明顯的活性氧代謝。而ΔCgNoxA菌絲尖端幾乎沒有形成沉淀，說明其活性氧代謝出現(xiàn)異常；在ΔCgNoxB和ΔCgNoxR突變株中，活性氧代謝水平與野生型菌株相比也出現(xiàn)一定程度的下降。而ΔCgNoxC中活性氧代謝沒有受到影響。

3 討論

在植物與病原菌互作的過程中，ROS作為一種信號分子起著重要作用。在受到病原菌侵染時，寄主植物通過激活一系列信號通路、調(diào)節(jié)自身代謝，從而產(chǎn)生大量ROS。一方面，這些ROS能夠作為信號分子激活植物的抗病反應(yīng)，另一方面，這些ROS能夠直接對病原菌產(chǎn)生氧化損傷［13］。近年來的研究表明，在入侵植物的過程中，病原真菌自身也能夠產(chǎn)生ROS，這些ROS能夠作為信號分子調(diào)節(jié)病原真菌的生長、發(fā)育及致病力［5］。而在真菌中，Nox蛋白就是 ROS 的主要來源之一［7，10］。

在橡膠樹膠孢炭疽菌中，存在3個編碼Nox的基因CgNoxA、CgNoxB及CgNoxC。通過檢測這3個基因敲除突變株的表型發(fā)現(xiàn)，CgNoxA與膠孢炭疽菌分生孢子的產(chǎn)生密切相關(guān)，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在離體培養(yǎng)條件下孢子生成受到影響；而CgNoxB與病原菌對橡膠樹葉片的致病力密切相關(guān)，該基因的缺失突變株對葉片的侵染能力、以及侵染后病斑的擴展能力顯著下降。Nox蛋白主要通過調(diào)節(jié)ROS的代謝來控制病原真菌的表型［7，10］。

為了檢測CgNox蛋白是否與橡膠樹膠孢炭疽菌的ROS代謝相關(guān)，本研究中檢測了這3個突變株菌絲中的ROS代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CgNoxA缺失突變株中ROS代謝受到明顯影響，NBT染色法很難檢測到ROS，說明CgNoxA是橡膠樹膠孢炭疽菌中ROS的主要來源。此外，在橡膠樹膠孢炭疽菌基因組中還發(fā)現(xiàn)了一個編碼Nox調(diào)節(jié)蛋白的基因CgNoxR。該調(diào)節(jié)蛋白在調(diào)控Nox蛋白活性中起著重要作用［14-16］，在橡膠樹膠孢炭疽菌中，敲除該基因會導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)過程產(chǎn)生異常、致病力下降等現(xiàn)象，說明該調(diào)節(jié)蛋白對病原菌的正常的生理功能有著重要作用。

圖4 致病力檢測

圖5 不同菌株的菌絲中活性氧代謝情況檢測

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建橡膠樹膠孢炭疽菌中CgNoxA、CgNoxB、CgNoxC及CgNoxR的缺失突變株，以及對突變株表型的分析發(fā)現(xiàn)，Nox蛋白在調(diào)節(jié)該病原菌的孢子產(chǎn)生、致病力過程中起著重要作用。這4個基因可能通過參與調(diào)節(jié)真菌細胞內(nèi)活性氧代謝途徑，調(diào)控病原菌的生理功能。