代謝工程法強化惡臭假單胞菌利用木質(zhì)素積累PHA的能力

高慶龍 陳升寶 田文佳 張學銘 馬玉超

（1北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京 100083；2 北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，北京 100083）

PHA（Polyhydroxyalkanoates，聚羥基脂肪酸酯）是一種高值生物聚合物，可作為生物塑料或粘合劑［1］，可被分解轉(zhuǎn)化成藥物或手性化合物的中間體［2］，也可經(jīng)甲酯化后作為生物柴油［3］。中長鏈PHA的生產(chǎn)一般采用葡萄糖、有機酸或烷烴等作為碳源和能源，采用脈動給料法和分批給料法等生產(chǎn)工藝發(fā)酵生產(chǎn)PHA。該法雖PHA產(chǎn)量高，但是碳源底物增加了生產(chǎn)成本，限制了PHA的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。利用來源廣泛、價格低廉的木質(zhì)素生物合成PHA是未來的發(fā)展趨勢，更是當前的研究熱點之一。

木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素的主要成分之一，約占自然界中木質(zhì)纖維素干重的15%-30%，是僅次于纖維素的可再生生物質(zhì)資源，也是含量最為豐富的芳香族類聚合物。木質(zhì)素由3種苯丙烷單體通過C-O、C-C等化學性質(zhì)穩(wěn)定的化學鍵連接構(gòu)成［4］，很難被分解利用，經(jīng)常作為廢棄物燃燒產(chǎn)熱，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染［5-8］。目前有很多關(guān)于木質(zhì)素高溫降解和化學催化降解方面的報道［9-10］，但是所獲得的產(chǎn)物是混合物，使木質(zhì)素的高值化利用成為了一個挑戰(zhàn)。木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn)化涉及多個步驟，主要包括木質(zhì)素解聚，芳香族化合物利用和代謝產(chǎn)物形成等過程。每一步都需要多種酶的參與。細菌具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性、強大的產(chǎn)物積累能力、相對較短的生長周期、以及較成熟的遺傳操作系統(tǒng)等，在木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。但是，細菌的木質(zhì)素降解能力遠遠低于白腐真菌［11-12］，而且系統(tǒng)研究細菌木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化過程的研究相對較少［13-14］。因此，對木質(zhì)素降解細菌進行代謝工程改造，使菌株合成有價值的化學品或其他高值化合物，將為木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化途徑的系統(tǒng)性研究和全局調(diào)控提供研技術(shù)基礎(chǔ)和研究思路［15］。

在限制氮源的條件下，P. putidaKT2440可利用木質(zhì)素合成PHA［8，14］。在細菌中，hsdR基因一般編碼限制-修飾系統(tǒng)中I型限制酶EcoK或EcoB的一個亞基。宿主的限制-修飾現(xiàn)象能辨別自身的DNA與外源DNA，并能使后者降解掉。為了便于對P.putidaKT2440進行遺傳操作，前期我們通過同源重組構(gòu)建了hsdR基因缺失突變株P(guān). putidaQSR1。本文以QSR1為出發(fā)菌株，采用代謝工程的方法，強化該菌株利用木質(zhì)素積累PHA的能力，旨在探索提高木質(zhì)素轉(zhuǎn)化效率的方法，為PHA的高效、低成本生產(chǎn)提供研究思路。

表1 實驗多用的質(zhì)粒和菌株

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 相關(guān)菌株、質(zhì)粒與試劑 本實驗所用到的質(zhì)粒和菌株見表1。用于構(gòu)建載體的引物由Invitrogen公司合成，DNA Ladder、限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶Mix、T4 DNA連接酶、PCR純化和膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，細菌基因組提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。玉米芯木質(zhì)素由山東龍力生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl；S.O.C培養(yǎng)基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 mmol/L NaCl，2.5mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MgSO4；10×M9溶 液 ：6.78 g/L Na2HPO4（15.138 g/L Na2HPO4·12H2O）、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl；微量 元 素 液：CuSO4、MnSO4、FeSO4、ZnSO4各 100 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 pK18PHAC1C2質(zhì)粒的構(gòu)建 首先，利用引物對PHAC1-F/R和PHAC2-F/R分別從P. putidaKT2440基因組中擴增phaZ基因的上游phaC1（1 772 bp）和下游phaC2（1 824 bp）DNA片段。接著，先將純化后的phaC1片段經(jīng)酶切、連接插入pUC18載體的Hind Ⅲ/XbaⅠ克隆位點，獲得載體pUCPHAC1；再將phaC2片段插入pUCPHAC1的KpnⅠ/XbaⅠ位點，獲得載體pUCPHAC1C2。然后，以pUCPHAC1C2為模板，利用引物對PHAC1-FH/PHAC2-RB擴增phaC1C2DNA片段，并將該片段插入pK18mobsacB載體的HindⅢ/BamH Ⅰ位點，構(gòu)建pK18PHAC1C2載體。

1.2.2 pVLTPHAZ質(zhì)粒的構(gòu)建 以PHAZ-FK/RH為引物，利用高保真DNA聚合酶從KT2440基因組中PCR擴增獲得phaZ基因的編碼區(qū)序列；該基因經(jīng)純化、酶切和連接插入pVLT33質(zhì)粒的KpnI/Hind III位點，獲得重組載體pVLTPHAZ。

1.2.3 pVLTDYPB質(zhì)粒的構(gòu)建 以dypB-FK/RH為引物，利用高保真DNA聚合酶從R. jostiiRHA1基因組［16］中擴增獲得dypB基因。之后，通過酶切和連接將純化后dypB基因片段分別插入pVLT33的KpnI/Hind III位點，獲得重組載體pVLTpelBDYPB。

表2 本實驗所用引物

1.2.4 突變株的構(gòu)建和篩選 采用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入E. coliS17-1及P. putidaQSRZ6；采用雙親接合法［17］將重組載體pK18PHAC1C2導入P.putidaQSR1。利用20%蔗糖篩選同源重組雙交換突變株；篩選過程中卡那霉素的使用濃度為50 μg/mL，氨芐青霉素的使用濃度為50 μg/mL；利用相應(yīng)引物的菌落PCR法驗證各步驟的突變株。

1.2.5 過氧化物酶酶活的測定 通過ABTS的氧化速率（?420=36 mmol·L-1·cm-1）來測定DypB的活性。1 mL的反應(yīng)體系中含有50 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.5），0.5 mmol/L H2O2，2.5 mmol/L ABTS 以及400 μL粗酶液（上清液）。使用酶標儀測定波長420 nm條件下1分鐘內(nèi)體系中吸光度的增加量。以每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為1個酶活單位U。

1.2.6 PHA提取和定量 以含有2 mL 1 mol/L MgSO4、1 mL 1 mol/L MnSO4、100 μL 1 mol/L CaCl2和1 mL微量元素溶液的1×M9為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH7.0），分別添加10 g/L葡萄糖和10 g/L玉米芯木質(zhì)素作為碳源和能源積累PHA。挑取平板上活化的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)；接著將菌液加入到四倍體積的新鮮的LB培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)2 h以達到對數(shù)生長期；然后按照5%的接種量將其接種到100 mL產(chǎn)PHA培養(yǎng)基中；30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)過程中的0 h，6 h，12 h，24 h，48 h取樣測量菌體的生長情況和PHA的積累情況。PHA的提取與定量參照Lu等［15］的方法。

2 結(jié)果

2.1 基因突變株的構(gòu)建

2.1.1 ?phaZ突變株的構(gòu)建 使用酶切連接的方法將phaZ基因上游phaC1片段和下游phaC2片段進行連接，并插入到pK18mobsacB中，構(gòu)建phaZ敲除質(zhì)粒pK18PHAC1C2。然后，通過雙親接合法將pK18PHAC1C2導入hsdR基因缺失突變株P(guān). putidaQSR1，再通過抗生素和蔗糖篩選獲得phaZ基因失活突變株P(guān). putidaQSRZ6（簡稱QSRZ6），并且利用引物對PHA-F/R（表2）進行PCR驗證。驗證引物PHA-F/R分別位于敲除片段上下游同源臂上，若phaZ被成功敲除，驗證引物所擴增的條帶應(yīng)為626 bp，若未敲除成功，擴增產(chǎn)物大小為1 426 bp（圖1-A）。

為了驗證phaZ缺失突變株的功能，我們構(gòu)建了phaZ的功能互補菌株。pVLT33為廣宿主表達載體，含有一個lacqI-tac啟動子。我們將phaZ基因（852 bp）插入該載體，利用引物對pVLT33-F/R進行PCR擴增驗證該質(zhì)粒正確后（圖1-B，驗證中引入了pVLT33上約200 bp序列），將其導入突變株QSRZ6獲得P. putidaQSRZ6 - pVLTPHAZ（后簡稱PVLTPHAZ）。

2.1.2 DypB強化表達菌株的構(gòu)建 來源于可降解木質(zhì)素R. jostiiRHA1的DypB蛋白是木質(zhì)素降解酶，屬于過氧化物酶類［18］。DypB屬于胞外酶，需要一段前導肽序列以協(xié)助其穿過細胞膜。通過SignalP4.1軟件分析，發(fā)現(xiàn)DypB序列前端不存在前導肽序列。在擴增DypB編碼基因時，通過引物在DypB的N端引入了編碼軟腐歐文氏菌PelB的前導肽序列（序列詳見表2中dypB-F中雙下滑線）。我們將pelBdypB基因片段分別插入載體pVLT33中，經(jīng)過PCR驗證（圖1-C），得到重組質(zhì)粒pVLTpelBDYPB，又利用電轉(zhuǎn)化法將這重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入phaZ缺失突變株QSRZ6中，得到P. putidaQSRZ6B（簡稱QSRZ6B）。

圖1 各基因突變株的驗證

2.2 phaZ基因缺失突變株的PHA積累能力

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是原核微生物在碳氮比失衡的情況下，作為碳源儲藏物的一種聚酯類物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價值。PhaZ具有mcl-PHA解聚功能，本研究構(gòu)建了phaZ基因缺失突變株（QSRZ6）和phaZ的功能互補菌株（PVLTPHAZ）。以P.putidaQSR1為對照，研究了phaZ基因和對菌體生長和細胞積累PHA的能力的影響。

以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)過程中，QSR1在24 h時進入穩(wěn)定期；功能互補菌株經(jīng)歷了較長時間的延遲期，較其他兩株菌生長緩慢；與QSR1相比，QSRZ6對數(shù)生長期延長，48 h時還在繼續(xù)對數(shù)生長，且生長量明顯增加，OD600達到0.55，提高了29%（圖2-A）。提取培養(yǎng)48 h的胞內(nèi)PHA，發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株QSR1的PHA產(chǎn)量為131 mg/L，由于過量表達PhaZ分解利用了部分PHA，功能互補菌株P(guān)VLTPHAZ產(chǎn)量僅為63 mg/L，而phaZ基因敲除突變株QSRZ6的PHA產(chǎn)量為236 mg/L，是出發(fā)菌株的1.8倍（圖2-B）。

在使用木質(zhì)素為碳源時，由于木質(zhì)素溶于培養(yǎng)基后使培養(yǎng)基顏色較深，若使用OD600不能很好表征生長量，所以我們選用菌落形成單位來表征菌株生長情況。從圖2-C中可看出，功能互補菌株的菌落形成單位（CFU/mL）明顯低于菌株QSR1和敲除突變株QSRZ6，而QSRZ6和QSR1的生長情況基本一致。QSR1、QSRZ6和PVLTPHAZ的PHA產(chǎn)量分別為44 mg/L、124 mg/L和31 mg/L。QSRZ6的PHA產(chǎn)量最高，是出發(fā)株的2.8倍（圖2-D），說明敲除phaZ基因?qū)SR1利用木質(zhì)纖維素積累PHA有顯著的提升。

2.3 P. putida QSRZ6B的PHA積累能力

在phaZ基因失活的基礎(chǔ)上，我們強化表達了R.jostiiRHA1的DypB。利用木質(zhì)素為唯一碳源和能源發(fā)酵培養(yǎng)過氧化物酶強化表達菌株時，與轉(zhuǎn)入空載體pVLT33的菌株P(guān). putidaQSRZ6-pVLT33相比，在48 h時QSRZ6B的菌落形成單位均提高了133%，菌體干重也提高146%。取24 h和36 h的樣品測定過氧化物酶活性，對照菌株自身存在過氧化物酶活性，但酶活在不同時段均處于較低水平；QSRZ6B的酶活分別為0.11 U/mL和0.23 U/mL。發(fā)酵48 h，QSRZ6B的PHA積累量為140 mg/L，較QSRZ6和QSR1分別提高了13%和218%（圖3）。上述結(jié)果表明，強化表達R. jostiiRHA1的DypB提高了菌株降解和利用木質(zhì)素的水平，使QSRZ6B的生長能力和PHA的積累能力都得到增強。

圖2 phaZ敲除突變株的生長和PHA的積累

圖3 菌株QSRZ6B的特征

3 討論

利用代謝工程法改造木質(zhì)素降解細菌是提高木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化率的一種有效方法，該方法可以通過表達有效的功能基因和敲除某些基因來定向合成和積累高值化合物。Vardon等［19］在敲除多余代謝分支的同時，又引入了aroY、catA和苯酚代謝通路操縱子，使P. putidaKT2440利用木質(zhì)素類似物積累己二酸，產(chǎn)量達到了13.5 g/L；Lu等［15］在蛋白組學和轉(zhuǎn)錄組學等方法的指導下，導入來源于放線菌的過氧化物酶的編碼基因dyp2、香草醛脫氫酶基因vanAB以及自身的PHA合成酶基因phaJ4和phaC1，使菌株P(guān). putidaA514利用預(yù)處理后的木質(zhì)素纖維素合成PHA的量提高至161 mg/L；以香草酸為碳源時PHA含率達到了73%。

本研究以P. putidaKT2440的hsdR缺失突變株為出發(fā)菌株，利用同源重組敲除了PHA代謝基因簇中phaZ基因，構(gòu)建了phaZ缺失菌株P(guān). putidaQSRZ6。在P. putidaKT2440 基因組中，PHA 合成相關(guān)基因以基因簇（phaC1ZC2- DFI）的形式存在，phaZ基因位于phaC1與 phaC2 基因之間［20］，其編碼蛋白PhaZ為胞內(nèi)mcl-PHA 解聚酶［21］，在碳源缺乏的條件下，代謝mcl-PHAs［22］。因此，敲除phaZ基因可能有利于PHA 的積累。而phaZ基因的上下游基因phaC1和phaC2是PHA 合成基因，在利用這兩個基因片段為敲除phaZ基因的同源臂的同時，需要避免引入堿基突變。為此，我們在擴增phaC1和phaC2基因時采用了高保真DNA 聚合酶，并通過測序驗證了QSRZ6中phaC1和phaC2的完整性。在分別以葡萄糖和木質(zhì)素為碳源培養(yǎng)QSRZ6時，該菌株的生物量明顯不同。這主要由于葡萄糖為簡單糖類，易被微生物代謝利用，而木質(zhì)素本身成分復(fù)雜，含有較多芳香族類化合物，需要誘導產(chǎn)生代謝酶類，從而降低了木質(zhì)素的利用。但不論利用葡萄糖還是木質(zhì)素，QSRZ6均獲得了最大的生物量，菌體干重較初始菌株分別提升了29%和48%。在以木質(zhì)素為碳源時，QSRZ6中PHA的積累量為124 mg/L，提高了1.8倍。Linger［13］等利用APL（木質(zhì)素含量約32%的玉米芯堿-蒽醌處理液，同時富含單糖和木質(zhì)素單體）發(fā)酵合成PHA的量為252 mg/L。相比之下，我們獲得的菌株QSRZ6B的PHA積累量要低44%。原因在于本文使用的木質(zhì)素為高純度堿木質(zhì)素（木質(zhì)素含量90%以上），僅含有少于5%的不同類型碳水化合物，比APL更為難利用，導致PHA的積累量也相應(yīng)較低。

進而我們又在QSRZ6菌株中引入來源于R. jostiiRHA1的過氧化物酶（DypB）編碼基因，構(gòu)建了菌株QSRZ6B以強化木質(zhì)素降解能力。在以木質(zhì)素為碳源的培養(yǎng)基中，該菌的生長量和過氧化物酶活性均得到了不同程度的提高，而且QSRZ6B的PHA的積累量達到140 mg/L，比QSRZ6和QRS1分別提高了13%和218%。Ahmad等［18］開展了相似的研究工作，構(gòu)建了R. jostiiRHA1的dypB的敲除突變株，dypB缺失菌株在降解木質(zhì)素方面均具有不同程度的下降，而且在大腸桿菌中重組表達的DypB也顯示出了對Kraft木質(zhì)素和麥草原木質(zhì)素的降解活性，表明DypB在木質(zhì)素的降解過程中具有一定的作用，與本實驗結(jié)果一致。

在hsdR基因缺失突變株的基礎(chǔ)上，本實驗又敲除了phaZ基因，獲得了hsdR-phaZ雙基因缺失突變菌株P(guān). putidaQSRZ6，該突變株可以作為全局調(diào)控木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)和PHA合成系統(tǒng)以提高利用木質(zhì)素積累PHA的優(yōu)勢出發(fā)菌株。進而我們利用該菌株強化表達的異源過氧化物酶，所獲得的代謝工程菌株QSRZ6B的生長情況和PHA的合成能力都得到了提高，說明采用代謝工程的方法對木質(zhì)素降解系統(tǒng)和PHA積累途徑進行基因修改是一種提高木質(zhì)素轉(zhuǎn)化和PHA積累量的有效方法。在未來的研究中，我們將對利用木質(zhì)素積累PHA的整體途徑進行深入研究和理性設(shè)計，進而將木質(zhì)素降解、芳香族化合物利用和高值產(chǎn)物的形成與積累結(jié)合起來，建立高效的利用木質(zhì)素積累PHA的細胞工廠，以實現(xiàn)木質(zhì)素的高效生物轉(zhuǎn)化和PHA的低成本合成。

4 結(jié)論

本實驗以P. putidaKT2440的hsdR缺失突變株P(guān).putidaQSR1為出發(fā)菌株，構(gòu)建了phaZ基因缺失突變株P(guān). putidaQSRZ6，進而在QSRZ6中強化表達了R. jostiiRHA1的過氧化物酶DypB，獲得了代謝工程菌株QSRZ6B。菌株QSRZ6的生物量和PHA積累量分別增長了48%和182%。QSRZ6B的PHA積累量達到了140 mg/L，相比QSRZ6和QSR1分別提高了13%和218%。