HPLC手性流動(dòng)相添加劑及其用于藥物對(duì)映體拆分中的影響因素

徐雄，寧衛(wèi)紅，瞿志榮，楊瑞卿，謝永榮＊

（1.贛南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西省高校功能材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西贛州 341000；2.杭州師范大學(xué)有機(jī)硅化學(xué)及材料實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 311121）

手性是自然界及生命過程的基本特征之一[1]。自從反應(yīng)停致畸事件以來，手性藥物引起了人們的廣泛關(guān)注，與此同時(shí)，手性藥物對(duì)映體的拆分引起了人們的重視[2-14]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前臨床常用的藥物中約有60%具有手性結(jié)構(gòu)[15]，而對(duì)于一些手性藥物來說，能夠產(chǎn)生藥理作用的多為其中的一種對(duì)映體，而另外一種對(duì)映體無藥理作用甚至產(chǎn)生顯著的副作用。此外，手性藥物所產(chǎn)生的藥理活性與其手性特征密切相關(guān)，藥物對(duì)映體在生物體內(nèi)一般表現(xiàn)出不同的藥理活性、代謝過程和毒理作用[16-17]。目前，臨床上的手性藥物要求使用光學(xué)純的對(duì)映異構(gòu)體，以確保藥物的安全性。因此，研究藥物對(duì)映體的拆分具有重要的實(shí)用價(jià)值。

現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了藥物對(duì)映體拆分技術(shù)的發(fā)展。高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法以及超臨界流體色譜法等是常用的儀器分析方法[18-26]，其中高效液相色譜法以分離效率高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快和對(duì)各種分析物具有通用性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究人員喜愛，被認(rèn)為是用于手性物質(zhì)分析分離最有效的方法[27]。

高效液相色譜分離手性物質(zhì)一般采用兩種方法：直接法和間接法。間接法（即手性衍生化法）分離是利用手性衍生化試劑與樣品反應(yīng)形成非對(duì)映異構(gòu)體，然后在非手性柱上進(jìn)行分離。柱效高、價(jià)格便宜是該法的優(yōu)點(diǎn)；但耗時(shí)且操作復(fù)雜，對(duì)手性試劑的純度、反應(yīng)過程中的穩(wěn)定性等要求較高。直接法分離使用手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑分離手性物質(zhì)，因其操作簡便及分離優(yōu)勢而得到優(yōu)先使用。然而，直接法分離中的手性固定相法因其條件的限制而不能被廣泛使用，如需要昂貴的手性柱以及嚴(yán)格的立體定向性等。相比之下，使用手性流動(dòng)相添加劑的方法分離物質(zhì)具有更明顯的優(yōu)點(diǎn)，（1）常規(guī)的非手性柱和普通流動(dòng)相即可實(shí)現(xiàn)分離，成本相對(duì)較低；（2）操作簡便，拆分效果好；（3）可選擇的手性添加劑種類多，范圍寬，應(yīng)用廣；（4）可以用于制備光學(xué)純藥物。因此，HPLC手性流動(dòng)相添加劑法為對(duì)映體分離提供了靈活的選擇。手性流動(dòng)相添加劑法是拆分藥物對(duì)映體最便利有效的方法之一[28-30]，其拆分原理是在流動(dòng)相中添加某種手性試劑，該手性試劑與對(duì)映體溶質(zhì)之間通過氫鍵、離子鍵、配位鍵或者空穴的包含作用等相互作用，形成非對(duì)映異構(gòu)體，然后根據(jù)非對(duì)映異構(gòu)體自身的穩(wěn)定性及其在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的拆分。

1 手性添加劑的種類及其拆分原理

1.1 環(huán)糊精類化合物

利用環(huán)糊精類化合物作為流動(dòng)相手性添加劑是通過環(huán)糊精的內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)對(duì)藥物對(duì)映體的包含作用，形成不同理化性質(zhì)的手性包含物，使其在流動(dòng)相和固定相中產(chǎn)生不同的分配系數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的拆分。常用的環(huán)糊精化合物有β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）、三甲基-β-環(huán)糊精（TM-β-CD）、羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）以及磺丁基醚-β-環(huán)糊精（SBE-β-CD）等，已應(yīng)用于拆分腎上腺素的前藥鹽酸地匹福林[31]、鹽酸替羅非班[32]、肌肉松弛藥美索巴莫[33]、鎮(zhèn)靜催眠藥佐匹克隆[34]、抗抑郁藥西酞普蘭[35]、非甾體抗炎藥阿卓乳酸[36]，β-腎上腺受體阻斷劑美托洛爾和多巴胺再攝取抑制劑文拉法辛[37]、鹽酸去甲苯福林[38]等。

1.2 手性金屬配合物

手性試劑與金屬離子形成的手性金屬配合物，加入色譜流動(dòng)相中，與拆分藥物的對(duì)映體作用，形成兩個(gè)非對(duì)映體配合物，它們與固定相發(fā)生立體選擇性吸附和排斥作用不同，從而產(chǎn)生色譜的分離。常用的手性金屬配合物中手性試劑通常是光學(xué)活性的氨基酸及其衍生物。它們適用于拆分氨基酸、羥基羧酸及其衍生物等。例如，L-脯氨酸、L-苯丙氨酸以及L-酒石酸及其衍生物，易于與過渡金屬Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Cd2＋等離子配位，形成手性金屬配合物，已大量用于拆分鹽酸莫西沙星[39]、氧氟沙星[40]、苯丙氨酸和色氨酸[41]、鄰氯扁桃酸[42]、色氨酸[43]、扁桃酸衍生物[44]和甲狀腺素[45]等。

1.3 手性離子對(duì)試劑

在色譜流動(dòng)相中，加入能與藥物對(duì)映體離子形成非對(duì)映體離子對(duì)的光學(xué)純?cè)噭?，即手性離子對(duì)試劑。常用的手性離子對(duì)試劑有奎寧、奎尼丁、N-芐氧羰基-S-苯基-L-半胱氨酸甲酯、10-樟腦磺酸、N-苯甲酰氧基羰基-甘氨酸-L-脯氨酸和酒石酸衍生物等顯堿性或酸性的試劑。手性離子對(duì)試劑的手性中心附近含有可離子化的官能團(tuán)，在低極性的有機(jī)流動(dòng)相中，與藥物對(duì)映體分子產(chǎn)生靜電作用或疏水性反應(yīng)而生成非對(duì)映體離子對(duì)，非對(duì)映體離子對(duì)具有不同的穩(wěn)定性，在流動(dòng)相與固定相之間的分配行為有差異，進(jìn)而差速遷移得以分離。手性離子對(duì)試劑已用于拆分普萘洛爾，苯丙醇胺、美托洛爾、腎上腺素和沙丁胺醇對(duì)映體[46-47]、胺類藥物[48]等。

1.4 手性氫鍵試劑

手性氫鍵試劑是指能與藥物對(duì)映體形成氫鍵，產(chǎn)生藥物的非對(duì)映體，而得以分離物質(zhì)。例如，N，N-二甲基-L-苯丙氨酸、N-乙酰基-L-纈氨酸-四丁酰胺等經(jīng)過修飾的氨基酸和二肽類，它們已用于拆分左旋多巴[49]、巴比妥類、氨基酸及其衍生物、氨基醇等[50-51]，它們通過在非極性或低極性的流動(dòng)相中與藥物對(duì)映體產(chǎn)生氫鍵作用來分離藥物對(duì)映體。

2 流動(dòng)相手性添加劑用于藥物對(duì)映體拆分時(shí)的影響因素

不同的手性添加劑及濃度、流動(dòng)相的pH與流速、柱溫和有機(jī)改性劑等都對(duì)手性藥物的拆分有影響，在具體應(yīng)用中應(yīng)不斷試驗(yàn)與探索，才能獲得最佳拆分效果。

2.1 不同的手性添加劑及濃度的影響

不同的手性添加劑具有不同的拆分原理，適用于不同結(jié)構(gòu)的手性藥物的拆分。通常一個(gè)有效的手性流動(dòng)相添加劑，需要經(jīng)過大量試驗(yàn)才能獲得。翟明翚等[31]利用環(huán)糊精（β-CD）、羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）和羧甲基-β-環(huán)糊精（CM-β-CD）拆分鹽酸地匹福林，獲得較好的試驗(yàn)結(jié)果。上述三種手性流動(dòng)相添加劑各自的拆分效果如圖1所示，可見羧甲基-β-環(huán)糊精才能獲得基線分離鹽酸地匹福林對(duì)映體的目的（圖1c）。

圖1 不同的手性添加劑拆分鹽酸地匹福林譜圖[31]

CM-β-CD不同濃度拆分鹽酸地匹福林的效果如圖2所示?？梢?，隨著CM-β-CD濃度的增加，分離度R于增大后減小，說明手性添加劑的濃度對(duì)藥物對(duì)映體的拆分有影響，不同的濃度可能會(huì)改變分子間的作用力。然而整體上不同濃度范圍內(nèi)的CM-β-CD對(duì)鹽酸地匹福林均有拆分效果，說明選取合適的手性添加劑對(duì)化合物的手性拆分的重要性。

圖2 手性添加劑濃度對(duì)分離度的影響

2.2 流動(dòng)相不同的pH值及流速的影響

對(duì)帶有酸性或堿性基團(tuán)的藥物分子，流動(dòng)相的pH對(duì)其對(duì)映體的拆分有較大的影響，在不同酸堿條件下，對(duì)化合物對(duì)映體的分離具有非常顯著的影響。翟明翚等[33]報(bào)道了用CM-β-CD手性流動(dòng)相添加劑拆分美索巴莫對(duì)映體的試驗(yàn)結(jié)果，圖3展示了不同流動(dòng)相pH值對(duì)美索巴莫左右旋體拆分的影響。可見，隨著流動(dòng)相pH值的增大，對(duì)映體拆分的分離度呈現(xiàn)拋物線變化，這是因?yàn)槊浪靼湍肿釉诓煌膒H值下具有不同的電離狀態(tài)（圖4所示），美索巴莫呈現(xiàn)出不同的分子結(jié)構(gòu)，與CM-β-CD產(chǎn)生出不同的作用力，使非對(duì)映體包合物得到速差遷移，實(shí)現(xiàn)拆分目的。

圖3 流動(dòng)相pH值對(duì)美索巴莫左右旋體拆分的影響

圖4 美索巴莫的電離平衡反應(yīng)

流速對(duì)美索巴莫左右旋體拆分的影響如圖5所示?？梢?，當(dāng)流速較快時(shí)，CM-β-CD與藥物對(duì)映體分子形成的二個(gè)非對(duì)映體包合物在固定相上吸附的時(shí)間較短，遷移差異小，分離效果降低。但流速慢，出峰時(shí)間長，峰形變寬，色譜峰拖尾嚴(yán)重，拆分效果也變差。因此不同的流速對(duì)其拆分呈現(xiàn)不同的分離效果和分離度，選取合適的中等流速能夠?qū)崿F(xiàn)化合物的有效拆分。

圖5 流速對(duì)美索巴莫左右旋體的拆分的影響

2.3 柱溫的影響

色譜柱溫的改變會(huì)影響流動(dòng)相中各分子的運(yùn)動(dòng)速率和解離狀態(tài)，從而影響藥物對(duì)映體與手性流動(dòng)相添加劑的作用原理，產(chǎn)生拆分效果的差異。張虎等[36]報(bào)道了用手性流動(dòng)相添加劑磺丁基醚-β-環(huán)糊精（SBE-β-CD）拆分阿卓乳酸對(duì)映體的研究。圖6展示了柱溫對(duì)拆分效果的影響。可見，隨著柱溫的升高，阿卓乳酸對(duì)映體的分離度逐漸減小，拆分效果變差。這可能是隨著柱溫的升高，阿卓乳酸對(duì)映體與手性流動(dòng)相添加劑SBE-β-CD的作用發(fā)生了改變，非對(duì)映體復(fù)合物穩(wěn)定性降低，色譜行為差異縮小，使拆分效果降低。

圖6 柱溫對(duì)阿卓乳酸對(duì)映體拆分效果的影響

通常柱溫越高，色譜保留時(shí)間越短，拆分效果越差；柱溫越低，保留時(shí)間越長，色譜峰變寬，分離度也下降，拆分效果越差，且柱溫過低會(huì)導(dǎo)致柱壓升高，損害色譜柱。所以，選擇合適的柱溫在藥物對(duì)映體拆分應(yīng)用中也很重要。

2.4 有機(jī)改性劑的影響

二元或多元溶劑系統(tǒng)組成的流動(dòng)相，通常用有機(jī)溶劑作為改性劑，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，改善色譜的峰形和平滑度，提高藥物對(duì)映體的分離效能。翟明翚等[38]選用了甲醇或乙腈作為有機(jī)改性劑，研究了用CM-β-CD手性流動(dòng)相添加劑拆分鹽酸去甲苯福林對(duì)映體的效果，圖7展示結(jié)果表明：甲醇-水、乙腈-水、以及甲醇-乙腈-水三種不同組成的溶劑系統(tǒng)組成的流動(dòng)相，拆分鹽酸去甲苯福林對(duì)映體的效果不同，其中甲醇-水系統(tǒng)組成的流動(dòng)相未達(dá)到拆分藥物對(duì)映體的效果，乙腈-水系統(tǒng)只實(shí)現(xiàn)部分對(duì)映體的拆分，而甲醇-乙腈-水系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的基線分離。可見，不同有機(jī)改性劑組成的流動(dòng)相對(duì)藥物對(duì)映體的拆分效果也影響很大。

圖7 有機(jī)改性劑的選擇及比例對(duì)分離度的影響

有機(jī)改性劑的作用大小與其本身的溶解性、pH值、極性以及黏度有關(guān)。通常拆分酸性藥物對(duì)映體選擇酸性有機(jī)改性劑，拆分堿性藥物對(duì)映體選擇堿性有機(jī)改性劑。常用的有機(jī)改性劑有甲醇、乙腈、三乙胺以及緩沖鹽溶液等。

3 結(jié)語

手性流動(dòng)相添加劑法是重要的對(duì)映體拆分方法之一，具有操作簡便、效率高、消旋化少、添加劑的選擇范圍寬等特點(diǎn)。能夠應(yīng)用于各種類型的手性藥物的拆分試驗(yàn)。隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會(huì)有越來越多的手性藥物拆分技術(shù)開發(fā)，手性流動(dòng)相添加劑法拆分藥物對(duì)映體技術(shù)也可以得到較大的發(fā)展。