Pb、Cd和酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響

陳順鈺， 趙雅曼， 李宗勛， 韓 航， 侯曉龍,2,3*， 蔡麗平,2,3

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院， 福建 福州350002； 2. 海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心， 福建 福州350002；3. 南方紅壤區(qū)水土保持國家林業(yè)局重點實驗室， 福建 福州350002)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人類對礦產(chǎn)資源的需求不斷增加。其中對礦產(chǎn)資源的不合理開發(fā)，誘發(fā)地質(zhì)災(zāi)害、破壞生態(tài)環(huán)境，造成礦山及其周圍環(huán)境的污染，對人類的生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響[1-3]。礦山廢棄地環(huán)境污染問題成為環(huán)境科學(xué)界研究熱點，廢棄地生態(tài)亟待修復(fù)。其中植物修復(fù)技術(shù)具有安全經(jīng)濟、綠色環(huán)保等優(yōu)點備受廣泛關(guān)注[4-5]。福建長汀屬離子型稀土礦區(qū)，在酸性條件下重金屬易被活化，且酸性越強釋放速度越快。長汀稀土開采時加入大量的硫酸銨或草酸就地淋浸，造成大量土壤pH值低的廢棄地、土壤重金屬污染嚴(yán)重，同時引起植被破壞、水土流失[6]。長汀重金屬污染主要為Pb、Cd，Pb在原地浸廢棄地、周邊未開采地達中度污染水平，在取土場中達輕度污染水平，廢棄堆浸池達重度污染水平；Cd在原地浸廢棄地、取土場、廢棄堆浸池的質(zhì)量比分別為福建省土壤背景值的141倍、97 倍、69倍；4個采樣區(qū)土壤Cd均達重度污染水平，綜合潛在生態(tài)風(fēng)險指數(shù)達極重污染水平[7-9]。

寬葉雀稗(PaspalumwettsteiniiHack)屬禾本科(Gramineae)黍亞科(SubFam. Panicoideae)雀稗屬(Paspalum)，是半匍匐熱帶型多年生禾草，具有耐旱、耐瘠薄，耐酸、耐鹽堿的強抗逆性，且根系發(fā)達，生長速度快，分蘗力和再生力強。寬葉雀稗以其優(yōu)良的特性成為南方水蝕荒漠化地區(qū)、礦山廢棄地、道路邊坡等生態(tài)惡地植被恢復(fù)中理想的先鋒植物[10-12]。當(dāng)前對寬葉雀稗的研究主要集中在水土保持、耐鹽抗旱性、破除種子休眠特性等方面[13-14]。王友生等[15]研究發(fā)現(xiàn)寬葉雀稗可在土壤Pb、Cd污染嚴(yán)重及酸化嚴(yán)重的長汀稀土礦廢棄地正常生長，且已成為長汀植被恢復(fù)的主要草種之一，其可能存在特殊的形態(tài)生理適應(yīng)機制。但Pb、Cd及酸脅迫對寬葉雀稗種子的萌發(fā)和生理適應(yīng)策略尚不清楚。

因此，本研究以寬葉雀稗為研究對象，設(shè)置不同梯度Pb、Cd、酸脅迫試驗，探討Pb、Cd及酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)特性和幼苗生長及抗氧化酶活性的影響。同時利用隸屬函數(shù)法，綜合評價不同逆境脅迫條件對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長的影響程度，以期為酸性礦山廢棄地和土壤重金屬污染地區(qū)的植被恢復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗材料為寬葉雀稗種子，購自廈門三水園林綠化工程有限公司。用0.3%高錳酸鉀溶液消毒浸泡寬葉雀稗種子30 min后，超純水沖洗6遍，然后用超純水浸泡24 h，除去漂浮的劣質(zhì)種子，余下的種子用濾紙吸干表面的水分，用于脅迫試驗。

1.2 試驗條件及方法

根據(jù)稀土礦廢棄地重金屬污染及土壤酸化程度，設(shè)置Cd、Pb濃度及pH值[16-19]，Cd、Pb脅迫采用分析純(CH3COO)2Cd·3H2O、(CH3COO)2Pb配制，濃度分別為：0(以去離子水對照)、25，50，100 mg·L-1，250，500，1 000 mg·L-1(文中以CK,Cd-25,Cd-50,Cd-100,Pb-250,Pb-500,Pb-1000表示)；pH調(diào)節(jié)采用CH3COOH，分別為3.5，4.5，5.5，CK(對照)。培養(yǎng)條件為溫度25℃、空氣相對濕度70%、光照14 h黑暗10 h、光強100%(RXZ-160A智能型人工氣候箱—寧波江南儀器廠)。鋪有兩張濾紙的直徑9 cm的玻璃培養(yǎng)皿，經(jīng)過高溫滅菌處理，編號，分別加5 mL各設(shè)置濃度的Cd、Pb和酸溶液，每個培養(yǎng)皿50粒種子，每個脅迫濃度6個重復(fù)，其中3個重復(fù)用于測定幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)，另外3個重復(fù)用于測定萌發(fā)過程中抗氧化酶活性及MDA含量。每天稱重法補水，保持濾紙濕潤。每天觀察記錄種子萌發(fā)情況。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1種子發(fā)芽指標(biāo)測定 每24 h對發(fā)芽情況進行統(tǒng)計記錄，以種子露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。參試種子連續(xù)3 d不發(fā)芽時計算發(fā)芽率，發(fā)芽結(jié)束。發(fā)芽指標(biāo)參照王文娟等[14]方法：

發(fā)芽率=萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt指在t時間內(nèi)萌發(fā)數(shù)，Dt為相應(yīng)的萌發(fā)天數(shù))

發(fā)芽勢=發(fā)芽7 d萌發(fā)的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗長度

1.3.2形態(tài)學(xué)指標(biāo)測定 第14 d發(fā)芽結(jié)束，從用于測幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)的培養(yǎng)皿中各取出20株長勢一致的幼苗，用游標(biāo)卡尺測量幼苗地上部分長及根長，讀數(shù)精確到0.01 mm；用電子天平稱幼苗的地上部與根的鮮重，再置于烘箱105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重，稱各部分干重。

1.3.3生理指標(biāo)測定 發(fā)芽第4 d、7 d和10 d，從用于測生理指標(biāo)的各濃度培養(yǎng)皿中取出0.2 g發(fā)芽種子，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，加入4 mL 0.05 mol·L-1(pH=7.8)磷酸緩沖液于離心管中，于4℃下10 000 rpm冷凍離心20 min，取上清液立即放入4℃冰箱儲存待測。參考王學(xué)奎[20]的方法測定丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法。紫外吸收法測發(fā)芽種子過氧化氫酶(CAT)活性。愈創(chuàng)木酚法測過氧化物酶(POD)活性。氮藍四唑光化還原法測定超氧化物岐化酶(SOD)活性。用多功能酶標(biāo)儀(IPBPinite M200 PRO，瑞士)測定各指標(biāo)的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)收集整理后，用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，用Origin 9.0作圖。采用單因子方差分析(One-way ANOVA)和多重比較法進行統(tǒng)計分析，用Tukey-HSD法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表示處理間數(shù)據(jù)差異顯著。

采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)值法對3種脅迫條件下寬葉雀稗種子萌發(fā)和幼苗生長進行綜合性評價，參考馬彥霞[21]等方法，公式如下：

如果指標(biāo)與抗逆性呈正相關(guān)X(ij)=(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

如果指標(biāo)與抗逆性呈負(fù)相關(guān)X(ij)=1-(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

式中：X(ij)表示i種類j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xj max、Xj min分別表示j指標(biāo)的最大值和最小值。

Mi=∑X(ij)式中：Mi表示第i類型的綜合隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb、Cd、酸脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)的影響

隨Pb脅迫濃度增加發(fā)芽率、活力指數(shù)依次顯著降低(P<0.05)，高濃度的重金屬Pb(≥500 mg·L-1)處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照(表1)。低濃度Cd脅迫(Cd-25)發(fā)芽率與對照相近且無顯著差異，Cd-100脅迫處理的發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照，隨Cd脅迫加強發(fā)芽勢與活力指數(shù)依次顯著減小。而酸處理對寬葉雀稗種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均無顯著影響。pH-4.5、pH-5.5處理下活力指數(shù)均高于對照，其中pH-4.5處理顯著高于對照，pH-3.5處理則相反。由此可見，除Cd-25外其余濃度重金屬Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，pH-4.5處理對寬葉雀稗種子活力指數(shù)起著促進作用。

表1 不同脅迫處理對寬葉雀稗種子萌發(fā)的影響Table 1 Seed germination of Paspalum wettsteinii under different treatments

注：不同小寫字母表示不同處理濃度間差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different lowercase letters within same column indicate significant differences at the 0.05 level,the same as below

2.2 Pb、Cd和酸脅迫對寬葉雀稗種子幼苗的影響

隨重金屬Pb、Cd濃度的增加，寬葉雀稗幼苗出現(xiàn)不同程度的毒害效應(yīng)。如圖1所示，對照幼苗生長良好，根系發(fā)達有較多側(cè)生根；Pb、Cd脅迫下寬葉雀稗幼苗出現(xiàn)發(fā)育不良，芽苗幼小，主根變短甚至出現(xiàn)“無根苗”現(xiàn)象。由表2可知，隨重金屬Pb、Cd脅迫濃度的加強，寬葉雀稗根系和地上部的鮮/干重、長度均呈遞減趨勢，并顯著低于對照(P<0.05)。由于高濃度(Pb-1000及Cd-100)脅迫發(fā)芽率低并出現(xiàn)“無根苗”和芽苗幼小癥狀，所以Pb-1000及Cd-100處理下樣品太少導(dǎo)致測量不出重量及長度。可見Pb-1000及Cd-100脅迫是寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長的耐受限。

隨pH值減小，地上部的鮮/干重、長度及根鮮重、長度均呈先增加后減少趨勢，在pH-4.5達最大值并顯著高于對照，分別比對照提高了94.54%,36.49%,52.96%,85.61%,51.97%，組間差異顯著(P<0.05)。說明pH-4.5促進寬葉雀稗幼苗的生長發(fā)育。

圖1 發(fā)芽第14天不同脅迫處理下的寬葉雀稗幼苗Fig.1 Paspalum wettsteinii seedlings growing for fourteenth days under different treatments

表2 不同脅迫處理對寬葉雀稗幼苗的影響Table 2 Effects of different treatments on Paspalum wettsteinii seedlings

2.3 種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化

隨Pb脅迫濃度的增加(表3)，發(fā)芽第4 d對照的POD活性顯著高于脅迫處理(P<0.05)，并呈遞減趨勢，對照的CAT活性顯著低于脅迫處理，呈先增后減變化并在Pb-500達到最大值，相比對照提高2.26倍。第7 d時對照的SOD活性顯著(P<0.05)高于脅迫處理，并呈遞減趨勢，對照的POD活性顯著(P<0.05)低于脅迫處理并呈先增后減趨勢，CAT活性變化規(guī)律則相反，在Pb-1000時達最大值。

SOD活性隨時間的變化，呈遞增趨勢。POD活性變化規(guī)律則與SOD活性相反。CAT活性隨時間增加先增后減，在第7 d達最大值并顯著高于第4,10 d的CAT活性?？梢姲l(fā)芽初中期(4,7 d)POD、CAT活性增加，保證了寬葉雀稗種子在Pb脅迫下的萌發(fā)，發(fā)芽后期(10 d)SOD活性相比前兩個發(fā)芽階段顯著增加，SOD在后期萌發(fā)過程中起主導(dǎo)作用。

由表4可知，隨Cd濃度的增加，第4 d時Cd-100的SOD、CAT活性顯著高于對照(P<0.05)，呈先減后增趨勢，第4 d的POD活性及第7 d的SOD活性均表現(xiàn)出對照顯著高于脅迫處理。第7 d時Cd-100的POD活性顯著高于對照并提高51.66%，CAT活性先增后減，其中Cd-50處理顯著高于對照，相比對照增加了104.19%。

隨發(fā)芽時間的變化，第10 d的SOD活性顯著(P<0.05)高于第4,7 d(除Cd-25外)，Cd脅迫下POD、CAT活性變化與Pb處理類似，第4 d的POD活性顯著高于第7,10 d的POD活性。CAT先增加后減少，并在第7 d達最大值且顯著高于第4,10 d的CAT活性。

表3 Pb脅迫下寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化Table 3 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different Pb treatments of Paspalum wettsteinii

注：不同大寫字母表示同一濃度不同萌發(fā)時期間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一萌發(fā)時期不同濃度間差異顯著(P<0.05)，下同

Note:Different capital letters indicate significant differences among different times under the same concentration at the 0.05 level;different lowercase letters show significant differences of the same time under different concentrations at the 0.05 level,the same as below

表4 Cd脅迫下寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化Table 4 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different Cd treatments of Paspalum wettsteinii

表5 pH脅迫下寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化Table 5 Changes of antioxidant enzyme activities during seed germination in different pH treatments of Paspalum wettsteinii

隨pH值減小，第4 d時pH-4.5的SOD活性顯著高于對照(P<0.05)，對照的POD活性顯著高于脅迫處理，而對照的CAT活性顯著低于脅迫處理，呈先增加后減少趨勢，并在pH-5.5處理下CAT達最大值是對照的3.19倍。第7 d時對照的SOD、POD活性顯著高于脅迫處理，且均呈先降后升的趨勢。第10 d時對照的SOD活性顯著高于脅迫處理且組間差異顯著，POD活性則相反，對照顯著低于脅迫處理(P<0.05)。

隨萌發(fā)時間的延長，第4 d的POD活性顯著高于第7d的POD活性，SOD活性則相反，CAT先增加后減少，第7 d的CAT活性顯著高于第4,10 d的CAT活性。

2.4 寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中MDA含量

寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中MDA含量變化如表6所示，隨Pb脅迫加強，萌發(fā)各階段(第4,7,10 d)Pb-1000均顯著高于對照(P<0.05)，分別是對照的1.82倍、15.5倍、5.75倍。第4,7 d時Cd-100處理MDA含量均顯著高于對照(P<0.05)，第7,10 d時pH-3.5處理下MDA含量均顯著高于對照。3種脅迫下MDA含量隨時間的變化均在第4 d時最大，整體呈遞減趨勢。

表6 不同處理下寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中丙二醛MDA/μmol·g-1含量的變化Table 6 Changes of MDA content during seed germination in different treatments of Paspalum wettsteinii

2.5 三種脅迫下寬葉雀稗種子萌發(fā)和幼苗生長的抗逆性綜合評價

單獨的指標(biāo)不能全面判斷3種逆境脅迫條件對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，通過綜合隸屬函數(shù)值可將各指標(biāo)綜合起來判斷其影響。從表7可以看出，各脅迫處理下寬葉雀稗種子及幼苗各測定指標(biāo)的綜合隸屬函數(shù)值大小為pH-4.5>pH-5.5>CK>pH-3.5>Pb250>Cd-25>Cd-50>Pb500>Cd-100>Pb1000，其中pH-4.5,pH-5.5處理綜合隸屬函數(shù)值均高于CK，分別比對照提高了26.68%,7.59%，可見兩種弱酸(pH-4.5,pH-5.5)對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長有一定促進作用。重金屬處理組綜合隸屬函數(shù)值均低于CK，說明重金屬處理均對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用，其中Cd-100(1.921)、Pb1000(1.543)處理分別比對照降低76.26%,80.93%，可見高濃度的Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗有較強的毒害作用。

3 討論

種子萌發(fā)和幼苗階段是植物生命周期中對環(huán)境脅迫相對比較敏感的階段[22]。通過觀察逆境脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，可以在一定程度上反映該植物對逆境脅迫的耐性[23]。張大鵬等[24]發(fā)現(xiàn)隨Pb2 +和Cd2 +濃度的增加，毛竹(Phyllostachysedulis)種子萌發(fā)與濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Pb2 +和Cd2 +對幼苗生長具有顯著的抑制作用。本研究中除Cd-25外，Pb、Cd脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長均具有顯著的抑制作用，與已有研究基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)pH-4.5處理對寬葉雀稗種子萌發(fā)過程中活力指數(shù)、幼苗的生長發(fā)育起著促進作用。強酸(pH-3.5)條件下，地上部長和鮮/干重保持相對穩(wěn)定，表現(xiàn)出對酸脅迫的較強耐性。與同樣可在長汀稀土礦廢棄地正常生長的類蘆(Neyraudiareynaudiana)相類似[9]，類蘆在pH-3.5處理仍能較正常生長；pH-4.5對類蘆根系生長有一定促進作用。同時，在本實驗中發(fā)現(xiàn)隨酸脅迫加強，萌發(fā)后期的寬葉雀稗種子及幼苗出現(xiàn)發(fā)霉情況，其中pH-3.5處理發(fā)霉腐爛嚴(yán)重，還有待于進一步研究。

表7 不同處理下寬葉雀稗各測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 7 Subordinate function values of each treatment effect on measurement index of Paspalum wettsteinii

種子吸脹過程中各種生理代謝反應(yīng)旺盛，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致種子生理活動難以順利進行。以SOD、POD及CAT等為代表的抗氧化酶系統(tǒng)是保證植物種子萌發(fā)過程中生理代謝順利進行的必要基礎(chǔ)，亦是評估植物種子適應(yīng)性的重要指標(biāo)[25]。只有抗氧化酶系統(tǒng)CAT、POD、SOD三者協(xié)調(diào)一致，才能使生物自由基維持在一個低水平狀態(tài)，從而防止被自由基的毒害[26]。本研究發(fā)現(xiàn)隨Pb脅迫加強，寬葉雀稗發(fā)芽第4 d的SOD、CAT活性及第7,10 d的POD均呈先增后減趨勢，第7 d的SOD、CAT活性變化規(guī)律則相反，這與井瑾等[25]在火棘種子中的研究結(jié)果一致。王瑜[27]等發(fā)現(xiàn)隨Cd濃度升高，不同狼尾草幼苗SOD、CAT活性增強。本試驗中隨Cd脅迫加強，第4,10 d的SOD、CAT活性先減后增，第7 d時Cd-100處理下POD活性顯著高于對照，此外Cd-50處理的CAT活性同樣顯著高于對照。隨酸脅迫加強，萌發(fā)中后期(7,10 d)的SOD活性及萌發(fā)初中期(4,7 d)的POD活性均表現(xiàn)出先減后增趨勢，第4,10 d的CAT活性則先增后減。

隨萌發(fā)進程的延長，Pb、Cd處理下3種抗氧化酶活性變化規(guī)律一致，發(fā)芽初中期POD、CAT活性增加，保證了寬葉雀稗種子在重金屬Pb、Cd脅迫下的萌發(fā)，發(fā)芽后期SOD活性相比前兩個發(fā)芽階段顯著增加，SOD在后期萌發(fā)過程中起主導(dǎo)作用。酸脅迫時，提高萌發(fā)初期POD活性、萌發(fā)中期CAT及SOD活性可促進寬葉雀稗種子萌發(fā)，同樣在萌發(fā)后期SOD活性的提高將O-2轉(zhuǎn)化為H2O2，減少對細(xì)胞造成傷害。抗氧化酶在清除活性氧，減輕脂膜過氧化、適應(yīng)逆境環(huán)境的能力存在差異[28]，但不同抗氧化酶活力相互協(xié)同配合，共同保障逆境脅迫下寬葉雀稗種子萌發(fā)過程的順利進行。

逆境脅迫會影響植物體內(nèi)抗氧化酶活性及其化學(xué)性質(zhì)等，活性氧水平上升產(chǎn)生大量丙二醛，造成膜脂過氧化作用，阻礙損害植物正常生長[28]。寬葉雀稗種子在萌發(fā)初期(4 d)MDA含量達最大值，隨時間變化MDA含量多呈下降趨勢后略有上升，并隨各脅迫濃度的加強，各階段多呈先增后減趨勢。這與楨楠種子萌發(fā)過程中丙二醛變化結(jié)果一致，MDA的含量在萌發(fā)初期較高，但隨著時間的推移下降后期略有升高[29]。本試驗僅探討了酸、Pb、Cd單獨脅迫，3種耦合脅迫條件下寬葉雀稗種子的萌發(fā)機理及幼苗的生長規(guī)律還需進行進一步探討，并對其成年植株的抗逆解毒機理、富集規(guī)律、分子水平及細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的影響還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

高濃度Pb(≥500 mg·L-1)、Cd(≥50 mg·L-1)脅迫對寬葉雀稗種子萌發(fā)和幼苗生長具有顯著的抑制作用。寬葉雀稗種子及幼苗對酸脅迫表現(xiàn)出較強耐性，pH-3.5處理下仍可正常生長，綜合隸屬函數(shù)值分析表明，兩種弱酸(pH-4.5,pH-5.5)對寬葉雀稗種子萌發(fā)及幼苗生長有一定促進作用，其中pH-4.5處理效果最佳。

3種脅迫處理下CAT活性均呈先增后減趨勢，POD活性均表現(xiàn)為下降趨勢，SOD活性則相反。寬葉雀稗抗氧化酶系統(tǒng)在Pb、Cd及酸脅迫下應(yīng)答機制不同，SOD、POD、CAT活性高低存在明顯的萌發(fā)時間差異和濃度效應(yīng)。隨時間變化MDA含量多呈下降趨勢后略有上升，并隨各脅迫濃度的加強，各階段多呈先增后減趨勢。不同抗氧化酶相互協(xié)同配合作用可能是寬葉雀稗耐重金屬及酸脅迫的重要機制之一。