急性肺挫傷早期肺泡灌洗液表面活性蛋白與TNF-α、IL-32的變化趨勢(shì)及相關(guān)性

李東錦 王偉 熊新明 方丹青

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胸外科（廣州 510260）

胸部鈍器傷及其并發(fā)癥約占所有鈍器傷致死人數(shù)的25%，而這些患者中約30%～75%伴有肺挫傷［1］。嚴(yán)重肺挫傷時(shí)，肺組織水腫，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)使肺功能?chē)?yán)重受損，如不及時(shí)進(jìn)行有效的治療可能會(huì)發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合癥，后果更為嚴(yán)重。因此在急性肺挫傷早期進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和治療尤為重要。在既往的實(shí)驗(yàn)中［2］肺表面活性物質(zhì)（PS）在急性肺挫傷后的替代治療中，其保護(hù)肺功能及抑制炎癥反應(yīng)的作用得到了肯定。現(xiàn)今肺表面活性物質(zhì)蛋白（SP）及其表達(dá)的研究越來(lái)越深入，但尚未見(jiàn)對(duì)SP-A、B、C、D及其參與調(diào)控的炎癥因子IL-32及TNF-α在急性肺挫傷早期的整體變化趨勢(shì)及其相關(guān)性做出整體概述的報(bào)道，本文通過(guò)建立兔肺挫傷模型，研究急性肺挫傷早期SP-A、B、C、D與TNF-α、IL-32的變化趨勢(shì)及相關(guān)性，從而為進(jìn)一步研究急性肺挫傷時(shí)SP蛋白在炎癥調(diào)控中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36只新西蘭白兔，雌性，由廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2008A006），體質(zhì)量2.0～ 2.5 kg。

1.2 分組與處理36只新西蘭白兔隨機(jī)數(shù)字分組法分為急性胸外傷肺挫傷組（n=30）及正常無(wú)損傷對(duì)照組（n=6）。其中肺挫傷組參照方丹青［2］的方法建立急性肺挫傷模型，根據(jù)挫傷時(shí)間分為6組，每組5只。分別于1、2、3、4、8、12 h經(jīng)兔頸靜脈取血，離心機(jī)離心處理后取上清液存放至-70℃冰箱內(nèi)待測(cè)TNF-α及IL-32含量。然后立即處死實(shí)驗(yàn)兔，解剖胸腔，完整取出右肺，沿右主支氣管注入4℃生理鹽水，每次20 mL，共3次，收集BALF置于-70℃冰箱中保存待測(cè)SP-A、B、C、D、TNF-α及IL-32含量。在右肺挫傷明顯處取一小塊挫傷組織，以甲醛及戊二醛固定后置于4℃冰箱內(nèi)保存，分別送電鏡檢查。

1.3 TNF-α、IL-32檢測(cè)采用雙抗夾心ELISA法（通用型抗TNF-α、IL-32的ELISA檢測(cè)試劑盒由美國(guó)Sigema公司提供）分別測(cè)定血清及BALF中的TNF-α、IL-32含量，分別測(cè)定肺挫傷后血清及BALF中不同時(shí)段各組中TNF-α、IL-32濃度，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查找各時(shí)相點(diǎn)樣品濃度。

1.4 SP-A、B、C、D檢測(cè)將收集的BALF樣本在5 000 r/min速離心2 min后棄上清液，沉淀加入凝膠加樣緩沖液后，置于美國(guó)Biorad公司垂直蛋白電泳儀跑帶，以英國(guó)UVP公司凝膠圖像分析系統(tǒng)照相及處理數(shù)據(jù)。

1.5 肺組織病理學(xué)檢測(cè)將取得的肺組織標(biāo)本經(jīng)醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色后，置于投射電鏡下觀(guān)察肺泡組織的病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用兩變量相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡下急性肺挫傷后病理學(xué)檢查電鏡下急性肺挫傷后1 h挫傷部位肺泡細(xì)胞已有損害，肺泡及毛細(xì)血管充血水腫，肺組織內(nèi)可見(jiàn)少許紅細(xì)胞（圖1）；挫傷后4 h肺泡腔充血水腫加重，可見(jiàn)有白細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)至肺泡腔（圖2）；8 h后挫傷肺泡間質(zhì)出血，肺泡細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，可見(jiàn)細(xì)胞核縮小，細(xì)胞器溶解（圖3）；12 h后挫傷肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)出血嚴(yán)重，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損（圖4）。

2.2 急性肺挫傷后血清及BALF中TNF-α和IL-32含量的變化急性肺挫傷后1 h后血清及BALF中TNF-α濃度開(kāi)始升高，在3 h達(dá)到峰值，在4 h時(shí)出現(xiàn)明顯下降后，4～12 h相對(duì)穩(wěn)定在較高的表達(dá)水平直至試驗(yàn)結(jié)束，各時(shí)相與對(duì)照組比較（P＜0.05），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-32的表達(dá)同樣在肺挫傷1 h后明顯上升，在2 h后即可達(dá)到本實(shí)驗(yàn)中的高峰水平，3 h含量小幅度下降后，4～12 h均維持在較高水平直到試驗(yàn)結(jié)束，各時(shí)相與對(duì)照組比較（P＜0.05），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1，圖5、6。

2.3 急性肺挫傷后BALF中SP-A、B、C、D與血清及BALF中TNF-α、IL-32水平相關(guān)性分析BALF

中SP-A與TNF-α含量水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.122，P=0.03），SP-B、C、D與TNF-α含量水平均無(wú)顯著相關(guān)性；BALF中SP-A、D與IL-32含量水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.192，P=0.01；r=-0.077，P=0.01），SPB、C與IL-32含量水平均無(wú)顯著相關(guān)性；血清中TNF-α與IL-32呈正相關(guān)（r=1.163，P=0.01）。

2.4 急性肺挫傷后BALF中SP-A、B、C、D含量的變化SP-A、B、C、D含量在1～4 h中呈快速下降趨勢(shì)，在4～12 h相對(duì)穩(wěn)定在較低的水平，各時(shí)相點(diǎn)與對(duì)照組相比（P＜0.05），整體SP-A較SP-C、B、D下降明顯（P＜0.05）。其中SP-A在挫傷后1 h下降幅度最大，在8 h下降幅度達(dá)到最低點(diǎn)，SP-B、C、D肺挫傷后整體呈持續(xù)緩慢下降，在4 h下降幅度達(dá)到最低，4～12 h維持在較低水平（表1）。各時(shí)相點(diǎn)之間比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

PS與呼吸系統(tǒng)的各類(lèi)疾病的發(fā)展均有密切聯(lián)系，其中最重要的急性肺損傷導(dǎo)致的呼吸窘迫綜合征中地位尤為突出。PS可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，以減輕局部炎癥反應(yīng)和全身毒性的作用，同時(shí)降低肺表面張力，穩(wěn)定肺泡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，維持通氣/血流比例及肺功能，是一種很有前途的肺損傷的生物標(biāo)志物［3］。

表1 肺挫傷后BALF中SP-A、B、C、D（ng/mL）、TNF-α（pg/mL）及IL-32（pg/mL）含量變化Tab.1 Content of SP-A，B，C，D and content of TNF-α，IL-32 in BALF after acute pulmonary contusion ±s

表1 肺挫傷后BALF中SP-A、B、C、D（ng/mL）、TNF-α（pg/mL）及IL-32（pg/mL）含量變化Tab.1 Content of SP-A，B，C，D and content of TNF-α，IL-32 in BALF after acute pulmonary contusion ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

指標(biāo) 組別時(shí)間SP-A SP-B SP-C SP-D TNF-α IL-32對(duì)照組肺挫傷組對(duì)照組肺挫傷組對(duì)照組肺挫傷組對(duì)照組肺挫傷組對(duì)照組肺挫傷組對(duì)照組肺挫傷組1 h 74.60±2.53 32.51±3.86*14.83±1.24 5.29±0.58*10.89±1.37 5.03±1.02*39.25±1.98 28.64±1.44*84.31±13.77 97.31±21.07*67.34±16.11 107.34±21.45*2 h 74.60±2.53 14.12±2.48*14.83±1.24 3.03±0.78*10.89±1.37 1.98±0.84*39.25±1.98 13.02±1.01*84.31±13.77 247.62±61.21*67.34±16.11 346.28±67.12*3 h 74.60±2.53 7.96±1.39*14.83±1.24 1.58±0.54*10.89±1.37 1.43±0.21*39.25±1.98 6.46±0.45*84.31±13.77 291.74±59.63*67.34±16.11 316.22±77.21*4 h 74.60±2.53 8.15±1.11*14.83±1.24 0.77±0.11*10.89±1.37 0.97±0.23*39.25±1.98 1.36±0.19*84.31±13.77 114.99±31.05*67.34±16.11 243.11±31.59*8 h 74.60±2.53 6.47±0.97*14.83±1.24 0.71±0.21*10.89±1.37 0.88±0.17*39.25±1.98 1.77±0.27*84.31±13.77 126.33±24.47*67.34±16.11 224.77±46.57*12 h 74.60±2.53 10.21±1.75*14.83±1.24 0.97±0.19*10.89±1.37 1.04±0.19*39.25±1.98 1.59±0.21*84.31±13.77 151.26±37.21*67.34±16.11 267.55±44.79*

圖1 電鏡下肺挫傷后1 h肺泡變化，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色（× 6 000）Fig.1 Alveolar changes at 1 h after lung contusion under electron microscopy，dual staining of uranium acetate and lead nitrate（× 6 000）

圖2 電鏡下肺挫傷后4 h肺泡變化，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色（× 4 000）Fig.2 Alveolar changes at 4 h after lung contusion under electron microscopy，dual staining of uranium acetate and lead nitrate（× 4 000）

圖3 電鏡下肺挫傷后8 h肺泡變化，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色（× 6 000）Fig.3 Alveolar changes at 8 h after lung contusion under electron microscopy，dual staining of uranium acetate and lead nitrate（× 6 000）

圖4 電鏡下肺挫傷后12 h肺泡變化，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色（× 4 000）Fig.4 Alveolar changes at 12 h after lung contusion under electron microscopy，dual staining of uranium acetate and lead nitrate（× 4 000）

圖5 肺挫傷后血清中TNF-α含量Fig.5 Content of TNF-α in serum after acute pulmonary contusion

TNF不僅具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，也在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、組織損傷與修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過(guò)程中有著重要作用［4］。有研究［5］表明，IL-32在炎癥反應(yīng)中可參與并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等產(chǎn)生，在早期炎癥反應(yīng)中具有重要的地位。

圖6 肺挫傷后血清IL-32含量Fig.6 Content of IL-32 in serum after acute pulmonary contusion

實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立早期兔肺挫傷模型，測(cè)定肺挫傷后1、2、3、4、8、12 h BALF中SP-A、B、C、D與血清及BALF中炎癥因子TNF-α、IL-32的變化趨勢(shì)及相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)中1～4 h時(shí)：血清及BALF中TNF-α在2～3 h時(shí)快速上升至峰值，其原因?yàn)槊?xì)血管和肺內(nèi)皮的損傷，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞附著在并遷移到間質(zhì)和肺泡空間產(chǎn)生TNF-α等，而TNF-α又可激活選擇素、細(xì)胞黏附分子及血管粘附因子等炎性信號(hào)分子，使其在局部和全身水平上啟動(dòng)、傳導(dǎo)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，并再次以正反饋的形式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞脫顆粒，形成免疫炎癥的瀑布反應(yīng)［6-7］。而IL-32在肺挫傷后2 h即可達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)峰值，可能因?yàn)镮L-32為是一種前炎癥細(xì)胞因子［8］，在炎癥最初期即可大量產(chǎn)生，并誘導(dǎo)后續(xù)各種相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，在實(shí)驗(yàn)中比TNF-α水平更早達(dá)到峰值。肺挫傷后1～4 h時(shí)BALF中所有SP蛋白含量均呈下降趨勢(shì)，其中以SP-A、D下降最為顯著?？赡茉蚍譃閮煞N：一種為肺挫傷時(shí)，挫傷組織PS的合成速率降低，在剩余的未受傷的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，PS合成的速率得到保護(hù)，甚至可以上升，但總的PS的生產(chǎn)減少了，這可能是與總體功能性的肺泡II型上皮細(xì)胞的數(shù)量減少有關(guān)［9］；另一種為大量炎癥TNF-α的釋放，可在肺挫傷各個(gè)時(shí)段誘導(dǎo)肺泡II型上皮細(xì)胞凋亡，并且有研究表明，在肺挫傷早期隨著炎癥因子的逐漸增多，致使炎癥因子與抗炎因子平衡失調(diào)，高濃度的炎癥因子對(duì)SP-A mRNA有明顯的抑制作用［10］。此時(shí)在電鏡下顯示1 h時(shí)肺挫傷部位充血，肺泡內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，此時(shí)肺組織炎癥反應(yīng)較輕，4 h時(shí)肺泡腔充血水腫加重，可見(jiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)。

另一方面，實(shí)驗(yàn)4～12 h時(shí)：SP在4 h后整體下降趨勢(shì)減緩，趨向于一個(gè)穩(wěn)定的低水平表達(dá)狀態(tài)，此時(shí)血清及BALF中TNF-α、IL-32在3～ 4 h開(kāi)始下降，4～12 h降至并穩(wěn)定在較高水平。造成這一現(xiàn)象的原因可能為：肺表面活性物質(zhì)蛋白（SP）在肺損傷的修復(fù)作用中占有重要地位，可抑制NF-κB因子的激活，同時(shí)激活JAK/STAT等通路，共同抑制炎癥反應(yīng)的加重［11］，從而使TNF-α無(wú)法持續(xù)升高。而IL-32對(duì)肺部炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展有重要促進(jìn)作用［12］，SP對(duì)各種肺部炎癥反應(yīng)均有抑制和保護(hù)作用，可以認(rèn)為SP對(duì)IL-32有一定抑制作用，這也與實(shí)驗(yàn)中SPI與L-32含量水平呈負(fù)相關(guān)結(jié)論相符。而其中SP的代謝至少需要3～11 h［13］，這也解釋了實(shí)驗(yàn)結(jié)果BALF中SP含量在4 h下降幅度明顯減緩，TNF-α、IL-32從早期高表達(dá)狀態(tài)進(jìn)去一個(gè)相對(duì)較高的穩(wěn)定趨勢(shì)。但4h SP含量仍然呈表達(dá)低水平，TNF-α、IL-32也維持在較高的水平，表示炎癥反應(yīng)仍占主導(dǎo)作用，與電鏡下肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)損傷相符合。

本文研究在急性肺挫傷早期BALF中SP-A、B、C、D與炎癥因子TNF-α、IL-32的動(dòng)態(tài)變化關(guān)系及相關(guān)性，結(jié)果顯示肺挫傷開(kāi)始后1h，SP-A、B、C、D均開(kāi)始下降并在4 h后維持在較低水平至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，TNF-α、IL-32早期升高后下降至相對(duì)穩(wěn)定的高水平表達(dá)狀態(tài)，與肺組織病理變化關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)中急性肺挫傷早期BALF中SP-A與TNF-α濃度水平聯(lián)系密切且呈負(fù)相關(guān)性，SP-A、D與IL-32含量水平呈負(fù)相關(guān)，血清中TNF-α與IL-32呈正相關(guān)，由此可推斷SP蛋白在肺挫傷早期可對(duì)炎癥因子TNF-α、IL-32的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。但肺挫傷后炎癥的形成與對(duì)抗的機(jī)制為復(fù)雜多樣化的，SP蛋白對(duì)IL-32、TNF-α的抑制機(jī)制有待進(jìn)一步研究。