內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

張強 徐亮

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科（四川瀘州 646000）

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤發(fā)生率的第4位，預(yù)后較差，其病死率高居世界第2位［1］。中國胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和病死的42.6%和45.0%，在全球183個國家中發(fā)病率位于第5位、死亡率第6位［2］。目前公認(rèn)的幽門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）感染是引起胃癌重要危險因素之一［3］。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)已將HP納入第一類致癌原［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［5］，但具體作用機制尚不完全清楚。本文探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料二氧化碳孵箱購買于日本三洋公司；酶標(biāo)儀購買于美國Thermo公司；電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳槽購買于Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購買于英國CytoFLEX公司；胃癌SGC-7901細(xì)胞是由西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心提供；培養(yǎng)基（RMPI 1640）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、澳洲胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；抗體蛋白免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BiP）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、凋亡蛋白（Caspase-3）及內(nèi)參（β-actin）購自美國Cell Signaling Technology公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配制試劑盒、BSA封閉液、山羊抗鼠、山羊抗兔、硝酸纖維素膜（PVDF）發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）、MTT試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司；衣霉素（tunicamycin，TM）及4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）購于美國Sigma公司；FITC Annexin V凋亡試劑盒購買于BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中加入濃度為10%胎牛血清和1%的雙抗，并培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱中，每隔1～2 d換液一次，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%左右進(jìn)行傳代。根據(jù)細(xì)胞不同處理條件，將對數(shù)期生長的細(xì)胞采用隨機分組法分為3組：對照組（Control）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組（ERS）、抑制劑組（4-PBA）。對照組采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組給以3.5 μmol/L衣霉素處理24 h；抑制劑組給以100 nmol/L的4-苯基丁酸處理24 h。

1.3 MTT法檢測各組細(xì)胞的活性經(jīng)過不同處理后的細(xì)胞，每瓶加入2 mL MTT液，37℃避光孵育4 h，棄去液體，各瓶加入2 mL二甲基亞砜振蕩15 min。每組細(xì)胞在96孔板上均設(shè)置5個復(fù)孔，每孔分別吸取200 μL細(xì)胞懸液，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm波長下的吸光度值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡各組處理后的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞2 min，溫柔吹打下細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min（r=25 cm）離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，重懸細(xì)胞計數(shù)至5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL試管中，加入5 μL FITC及5 μL PI，25 ℃條件下避光孵育15 min，加入1×緩沖液400 μL，1 h內(nèi)上機進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，每組重復(fù)檢測3次。

1.5 Western blot法檢測Bip、CHOP和Caspase-3蛋白的表達(dá)量處理后的細(xì)胞，吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞3次，吸盡PBS后，每組中加入含1%PMSF酶抑制劑及1%磷酸酶抑制劑的強RIPA細(xì)胞裂解液約600 μL，于冰上裂解30 min后，用細(xì)胞刮瓷刮下細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，超聲震蕩使細(xì)胞核破裂（5次，5 s/次），4℃離心（20 000 r/min，r=4 cm，15 min）去除沉淀后，用BCA測定蛋白濃度，配平蛋白濃度，加5×上樣緩沖液煮沸（100℃15 min），取相同質(zhì)量的蛋白上樣，于SDS-PAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)移至PVDF，5%的BSA常溫下封閉1 h，TBST洗膜3次（每次5 min），一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，曝光顯影。利用圖像分析軟件Fusion對條帶進(jìn)行灰度值定量分析，用“目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比”代表靶蛋白的量，重復(fù)3次實驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)P=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞的活性情況與對照組比較，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組胃癌SGC-7901細(xì)胞吸光度值明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而與對照組比較，抑制劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞的活性圖Fig.1 The proliferation of cells

2.2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率與對照組比較，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與對照組比較，抑制劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖2。

2.3 各組細(xì)胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白的表達(dá)量與對照組比較，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組SGC-7901細(xì)胞Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)量上調(diào)（增加倍），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與對照組比較，抑制劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果Fig.2 The percentage of cell apoptosis

圖3 各組細(xì)胞中Bip、CHOP及Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 The expression levels of Bip，CHOP and Caspase-3

3 討論

目前胃癌的主要治療方式采用以盡早的手術(shù)干預(yù)為主及輔助放化療的綜合治療，可顯著增加胃癌患者的生存率。但在我國大多數(shù)診斷的胃癌患者已為中、晚期胃癌，失去絕佳的手術(shù)機會，導(dǎo)致預(yù)后較差，病死率較高［6］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞的細(xì)胞器，參與重要的生理功能，如蛋白質(zhì)的加工廠，多種病理生理因素可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，引發(fā)蛋白質(zhì)合成障礙，而錯誤折疊和未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積，細(xì)胞為此將做出一系列的應(yīng)激反應(yīng)，即發(fā)生ERS反應(yīng)［7］，若ERS反應(yīng)較重，則凋亡信號通路會被激活，引起細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在許多腫瘤細(xì)胞中普遍存在［8］；BIP是一種分子伴侶，是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成及分泌的蛋白，正常情況下分泌較少，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，大量分泌，BIP高表達(dá)常被用作檢測ERS存在的標(biāo)準(zhǔn)［9］。BIP可識別錯誤折疊蛋白，協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、組裝、延伸和轉(zhuǎn)運、幫助未折疊蛋白質(zhì)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，防止未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)的輸出，保護(hù)細(xì)胞［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)［11］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用。人體胃癌組織中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)陪伴分子GRP78和GRP79高表達(dá)，且與腫瘤大小、侵襲深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)［12］。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激另一個特異轉(zhuǎn)錄性因子，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，當(dāng)ERS時，CHOP的表達(dá)量大大增加并聚集在細(xì)胞核內(nèi)，CHOP過量表達(dá)能使細(xì)胞凋亡；CHOP還可影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)，能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)［13］，提高線粒體對促凋亡因素的敏感性。Caspase蛋白屬半胱天冬酶家族，是ERS凋亡途徑中特異性凋亡介質(zhì)，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化，只能被ERS激活并能介導(dǎo)線粒體非依賴性的細(xì)胞凋亡［14-15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，SGC-7901細(xì)胞經(jīng)過3.5 μmol/L濃度的衣霉素處理24 h后，與對照組比較，MTT實驗示細(xì)胞的吸光度值（OD值）降低；流式細(xì)胞學(xué)示細(xì)胞的凋亡率增加；Western blot法示BiP、CHOP和Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)；而與對照組比較，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑組無明顯變化；揭示了衣霉素誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可引起細(xì)胞凋亡。通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可使腫瘤細(xì)胞呈程序性的死亡，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可對腫瘤的治療和預(yù)防在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激層面提出新思路。

綜上所述，衣霉素可誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)水平，引起胃癌細(xì)胞凋亡；然而，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程的機制十分復(fù)雜，有待于進(jìn)一步研究。