自噬在孤獨(dú)癥模型大鼠行為學(xué)及海馬PSD-95蛋白表達(dá)變化中的作用

劉 芬,周 波，文 敏，羅瑜平，陳運(yùn)華，艾 戎，童雪濤

孤獨(dú)癥，又稱(chēng)自閉癥，是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，主要表現(xiàn)為行為重復(fù)刻板和社會(huì)溝通障礙，部分患者伴有智力障礙，其發(fā)病率約0.6%，男女發(fā)病比率約為4 ∶1，迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1-2]。近年來(lái)，遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究鑒定的大量孤獨(dú)癥相關(guān)候選基因，如NLNG3/4、NRXN1、TSC1/2、FMR1等,其中大部分基因與突觸發(fā)育有關(guān)[3-6]，突觸已成為孤獨(dú)癥研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，突觸的發(fā)育與自噬密切相關(guān)，自噬在突觸發(fā)育中的作用已經(jīng)在果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)模型中得到證實(shí)，但其在哺乳動(dòng)物突觸發(fā)育中的作用仍不清楚[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在Wistar鼠孕12.5 d給于腹腔注射丙戊酸誘導(dǎo)孤獨(dú)癥動(dòng)物模型，運(yùn)用自梳理實(shí)驗(yàn)及三箱實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型是否成功，并給予自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制劑(3-methyladenine)干預(yù)孤獨(dú)癥大鼠，再次運(yùn)用自梳理實(shí)驗(yàn)及三箱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬干預(yù)前后孤獨(dú)癥大鼠行為變化，Western blot方法對(duì)比自噬干預(yù)前后孤獨(dú)癥大鼠海馬自噬相關(guān)蛋白(LC3-Ⅱ、Beclin 1)與突觸相關(guān)蛋白(PSD-95)的表達(dá)變化，探討自噬的變化在孤獨(dú)癥大鼠突觸發(fā)育中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料健康繁殖期 Wistar雌鼠20只(體質(zhì)量250～260 g)和雄鼠10只(體質(zhì)量270～280 g)，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (合格證號(hào)SCXK京[2014-0004])，丙戊酸鈉 (sodium valproate，VPA )(P4543)和LC3-Ⅱ兔抗鼠多克隆抗體(L8918)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；雷帕霉素(Rapamycin)(R-5000)購(gòu)自上海睿鉑賽生物科技有限公司；3-methyladenine(3-MA)(HY-19312)購(gòu)自MCE公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、RIPA裂解液、Beclin 1兔抗鼠多克隆抗體(bs-1353R)、β-actin兔抗鼠多克隆抗體(bs-0061R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PSD-95兔抗鼠多克隆抗體(#3409)購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2方法

1.2.1模型建立 參考Schneider et al[8]建模方法,選取健康成年Wistar雌鼠20只和雄鼠10只，雌雄鼠按2 ∶1比例于19:00合籠過(guò)夜，用苦味酸給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做標(biāo)記編號(hào)，次日早晨進(jìn)行雌鼠陰道涂片，光鏡觀(guān)察，涂片上觀(guān)察到精子的當(dāng)天計(jì)為妊娠(embryonic day，E)第1天 (E1)，孕鼠分籠飼養(yǎng)。在E12.5 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組孕鼠給予250 g/L的VPA (600 mg/kg)腹腔注射，產(chǎn)下的子代鼠為孤獨(dú)癥模型組，對(duì)照組孕鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水，產(chǎn)下的子代鼠為正常組。所有子代鼠出生當(dāng)日計(jì)為生后第1天 (postnatal，P1)。于P35在孤獨(dú)癥模型組中隨機(jī)取30只分為三組：自噬增強(qiáng)組給予腹腔注射雷帕霉素(5 mg/kg，溶于二甲基亞楓和PBS)1周；自噬抑制組給予腹腔注射3-MA(5 mg/kg，溶于PBS)1周，模型組給予同等劑量的溶劑腹腔注射。

1.2.2自梳理實(shí)驗(yàn) 自梳理實(shí)驗(yàn)用于描述大鼠刻板、重復(fù)行為。P42，將各組大鼠分別放置于標(biāo)準(zhǔn)鼠盒內(nèi)(長(zhǎng)30 cm×寬25 cm×高20 cm )，盒底覆蓋1 cm敷料，以阻止大鼠挖掘盒底，待大鼠在盒內(nèi)適應(yīng)5 min后，開(kāi)始視頻記錄10 min，觀(guān)察每只大鼠的活動(dòng)行為，再用秒表計(jì)數(shù)10 min內(nèi)每只大鼠用于梳理身體各區(qū)域的累計(jì)時(shí)間。

1.2.3三箱實(shí)驗(yàn) 三箱實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠社會(huì)交互行為和好奇行為。自制木箱(長(zhǎng)120 cm×寬45 cm×高50 cm)，木箱中間用2塊木板隔開(kāi)，使中間格長(zhǎng)60 cm，左右格長(zhǎng)均為30 cm，2塊隔板下方各有1個(gè)大小適宜且可開(kāi)關(guān)的門(mén)，可允許大鼠通過(guò)，在2邊格子中各放2個(gè)鐵絲鼠籠(可容納1只大鼠)。P42，將待測(cè)大鼠放置中間格子中，并關(guān)閉兩側(cè)可控門(mén)讓大鼠適應(yīng)5 min后，打開(kāi)兩側(cè)可控門(mén)，使大鼠在三個(gè)格子中可自由通行，再適應(yīng)5 min，然后在左邊格子的鼠籠中放置 1只陌生鼠(stranger1)，視頻記錄10 min，隨后在右邊格子的鼠籠中放置另一只陌生鼠(stranger2)，且stranger1不取出，視頻記錄10 min，分別計(jì)數(shù)2個(gè)10 min內(nèi)大鼠在左右格子中的活動(dòng)時(shí)間。

1.2.4Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin 1和PSD-95的表達(dá) 于P42冰上斷頸處死大鼠，迅速取大鼠海馬，稱(chēng)重后放入EP管中，加入適量RIPA裂解液(使用前已加入苯甲基磺酰氟PMSF)提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白樣品于10%SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應(yīng)抗體(LC3-Ⅱ兔抗鼠多克隆抗體1 ∶1 000、Beclin 1兔抗鼠多克隆抗體1 ∶1 000、PSD-95兔抗鼠多克隆抗體1 ∶1 000、β-actin兔抗鼠多克隆抗體1 ∶10 000)4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入相應(yīng)二抗(山羊抗兔IgG 1 ∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光液顯影曝光，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)檢測(cè)自梳理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠自梳理身體各區(qū)域時(shí)間，模型組(45.9±13.97)比正常組(25.4±9.00)明顯增加(F=3.842，P<0.01)，與模型組(治療后)(47.2±13.93)比較，Rap組梳理時(shí)間(28.3±11.26)顯著減少，3-MA組梳理時(shí)間(71.3±8.84)顯著增加(F=34.898，P<0.01)，提示模型組有重復(fù)行為，而Rap組重復(fù)行為較模型組有所減輕，3-MA組重復(fù)行為較模型組進(jìn)一步加重。

三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：前10 min，模型組在放有stranger1的格子中停留時(shí)間較正常組明顯減少(P<0.01)，而在放有空鼠籠(empty)的格子中停留時(shí)間較正常組明顯增加(P<0.01)；與模型組(治療后)比較，Rap組在stranger1的格子中停留時(shí)間增加(P<0.05)，在empty的格子中停留時(shí)間減少(P<0.05)；3-MA組則相反，在stranger1的格子中停留時(shí)間減少(P<0.05)，而在empty的格子中停留時(shí)長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3-MA組社會(huì)交往能力較模型組減弱。后10 min，模型組在放有stranger1的格子中停留時(shí)間較正常組增加(P<0.05)，而在放有stranger2的格子中停留時(shí)間較正常組減少(P<0.05)；與模型組(治療后)比較，Rap組在stranger1的格子中停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)，在stranger2的格子中停留時(shí)間明顯增加(P<0.05)；3-MA組在stranger1的格子中停留時(shí)間增加(P<0.01)，在stranger2的格子中停留時(shí)間減少(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2Westernblot檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin1和PSD-95的蛋白表達(dá)水平與正常組比較，模型組海馬LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，PSD-95蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)；與模型組(治療后)相比，Rap組LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05)，PSD-95蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，3-MA組LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.05)，PSD-95蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖1、2。

3 討論

3.1VPA化學(xué)干預(yù)法可成功誘導(dǎo)孤獨(dú)癥動(dòng)物模型VPA是一種廣泛使用的藥物，主要用于預(yù)防癲癇、偏頭痛和雙相情感障礙[7, 9]，在母孕期暴露于丙戊酸可引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷。人類(lèi)胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育始于神經(jīng)管，胚齡20～24 d為神經(jīng)管閉合時(shí)間，這段時(shí)間對(duì)應(yīng)到大鼠E12.5期間，該時(shí)間窗對(duì)孕鼠進(jìn)行VPA治療可誘導(dǎo)孤獨(dú)癥樣行為[9-10]。近年來(lái)，眾多證據(jù)表明，母孕期暴露于丙戊酸可增加自閉癥譜系障礙(ASD)的患病風(fēng)險(xiǎn)[11]。VPA誘導(dǎo)的子代鼠出現(xiàn)社會(huì)交往障礙[12]，重復(fù)和刻板行為[8, 12]，這些發(fā)現(xiàn)為孤獨(dú)癥模型的建立提供有力的證據(jù)。本研究參考Schneider et al[8]建模方法，該模型的解剖及發(fā)病機(jī)制與人類(lèi)的十分相似[13]，該動(dòng)物模型中可以觀(guān)察到VPA大鼠行為改變類(lèi)似于孤獨(dú)癥患者行為障礙。自梳理實(shí)驗(yàn)顯示，模型組較正常組理毛時(shí)間明顯延長(zhǎng)，提示模型組有重復(fù)、刻板行為；三箱實(shí)驗(yàn)顯示，模型組在放有stranger1的格子中停留時(shí)間較正常組減少，而在放有空鼠籠的格子中停留時(shí)間較正常組增加，提示模型組缺乏社會(huì)交往能力，且模型組在放有stranger1的格子中停留時(shí)間較正常組增加，而在放有stranger2的格子中停留時(shí)間較正常組減少(P<0.05)，提示模型組缺乏對(duì)新鮮事物的偏好，孤獨(dú)癥患者主要表現(xiàn)為重復(fù)、刻板行為及社會(huì)交往障礙。本研究方法所誘導(dǎo)的孤獨(dú)癥行為成功的模擬了孤獨(dú)癥患者的行為障礙，表明該模型建立成功。

3.2增強(qiáng)自噬促進(jìn)孤獨(dú)癥模型大鼠突觸發(fā)育突觸是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關(guān)鍵部位，其數(shù)量及結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)維持腦功能的正常發(fā)揮起著重要作用。突觸發(fā)育依賴(lài)于突觸相關(guān)蛋白合成與降解之間的動(dòng)態(tài)平衡[14]。Mashayekhi et al[15]提出SHANK3作為孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制的重要候選基因，該基因的缺失將導(dǎo)致突觸功能障礙；相關(guān)研究[3, 16]顯示mTORC1-eIF4E 通路異常激活，mRNA過(guò)度翻譯，導(dǎo)致突觸相關(guān)蛋白合成異常增強(qiáng)，突觸發(fā)育失衡，引起孤獨(dú)癥。可見(jiàn)，突觸相關(guān)蛋白合成與降解失衡，導(dǎo)致突觸發(fā)育障礙，可能是引起孤獨(dú)癥的重要機(jī)制之一[7]。本課題組在前期研究中也證實(shí)孤獨(dú)癥大鼠前額葉皮質(zhì) synaptophysin、PSD-95 等突觸相關(guān)蛋白表達(dá)異常增高。增強(qiáng)對(duì)過(guò)剩的突觸相關(guān)蛋白的降解，恢復(fù)合成與降解間的動(dòng)態(tài)平衡成為孤獨(dú)癥治療的關(guān)鍵策略之一。自噬溶酶體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的蛋白降解途徑，通過(guò)去除受損的細(xì)胞器和降解長(zhǎng)壽或易聚集蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡起著重要作用[4-5,7]，增強(qiáng)自噬可能通過(guò)促進(jìn)突觸蛋白的降解，改善孤獨(dú)癥的社交行為障礙。本研究通過(guò)母孕期化學(xué)干預(yù)法建立孤獨(dú)癥模型，證實(shí)孤獨(dú)癥大鼠自噬活性降低，突觸相關(guān)蛋白PSD-95異常增高，進(jìn)一步運(yùn)用自噬增強(qiáng)劑(雷帕霉素)和自噬抑制劑(3-MA)于P35干預(yù)孤獨(dú)癥模型，結(jié)果顯示增強(qiáng)自噬促進(jìn)了突觸相關(guān)蛋白PSD-95的降解，顯著改善了社會(huì)交互障礙和刻板重復(fù)運(yùn)動(dòng)等孤獨(dú)癥樣行為；反之，給于自噬抑制劑(3-MA)干預(yù)后，突觸相關(guān)蛋白PSD-95進(jìn)一步增多，孤獨(dú)癥樣行為進(jìn)一步加重?？梢?jiàn)，增強(qiáng)自噬可改善孤獨(dú)癥大鼠突觸發(fā)育, 進(jìn)一步改善孤獨(dú)癥大鼠行為，這一結(jié)果與Sato et al[6]研究一致，其研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素處理孤獨(dú)癥、結(jié)節(jié)性硬化癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)自噬可顯著逆轉(zhuǎn)小鼠模型的社會(huì)交互障礙。Tang et al[7]研究發(fā)現(xiàn)mTOR過(guò)度活化，導(dǎo)致自噬缺陷，引起孤獨(dú)癥樣行為改變，并引起突觸功能障礙，雷帕霉素治療可改善孤獨(dú)癥樣行為和突觸發(fā)育。

表1 各組大鼠三箱實(shí)驗(yàn)比較

與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組(治療后)比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組海馬Beclin 1、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)比較

A：正常組與模型組Beclin 1、LC3Ⅱ免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；A1：正常組與模型組Beclin 1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量比較；B：模型組(治療后)與3-MA組和Rap組Beclin 1、LC3-Ⅱ免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；B1：模型組(治療后)與3-MA組和Rap組Beclin 1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量比較；與正常組比較：*P<0.05；與模型組(治療后)比較：#P<0.05

圖2 各組海馬PSD-95蛋白表達(dá)比較

A：正常組與模型組PSD-95免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；A1：正常組與模型組PSD-95蛋白表達(dá)量比較；B：模型組(治療后)與3-MA組和Rap組PSD-95免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；B1：模型組(治療后)與3-MA組和Rap組PSD-95蛋白表達(dá)量比較；與正常組比較：*P<0.05；與模型組(治療后)比較：#P<0.05