張 炯,王 佳,王 芳,李貴森
腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是臨床上常見的一種臨床病理生理過程,是由于腎臟缺血及重獲血流灌注或氧供應(yīng)后, 對(duì)所產(chǎn)生的損傷作用。常繼發(fā)于腎移植、休克、心臟體外大循環(huán)手術(shù)等,是引發(fā)急性腎損傷乃至急性腎衰竭的常見原因[1-3],嚴(yán)重影響患者預(yù)后。如何減輕RIRI,成為改善腎功能的關(guān)鍵。蛇床子素(Osthole)是從天然植物蛇床中提取的一種單體,研究[4-5]顯示其具有抗病毒、抗氧化、抗炎、抗凋亡、增強(qiáng)免疫等多種生物學(xué)功能,并且毒副作用低,具有良好的臨床應(yīng)用前景?,F(xiàn)就蛇床子素在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及潛在機(jī)制進(jìn)行探討。
1.1材料30只健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量220~250 g,由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Osthole購自中國藥品生物制品檢定所,純度99.9%。Cleaved-Caspase3、Caspase3、Cleaved-Caspase9、Caspase9、Bax、BCL-2、Cyt C一抗均購于美國CST公司;ATP活性試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒和線粒體膜電位試劑盒均購于美國Ebioscience公司;水合氯醛、聚乙二醇、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核提取試劑盒均購于武漢谷歌公司。
1.2方法
1.2.1動(dòng)物分組與模型制備 30只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(Sham組)、腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI組)和蛇床子素組 (Osthole組)。Osthole組在術(shù)前45 min分別給予腹腔注射藥物Osthole(40 mg /kg),此劑量依據(jù)文獻(xiàn)[6]。Sham組和RIRI組在術(shù)前45 min給予腹腔注射等體積量的生理鹽水。參照Xie et al[6]建立大鼠RIRI模型。
1.2.2標(biāo)本收集 腎臟恢復(fù)血流再灌注24 h后,收集各組大鼠血清和左側(cè)腎臟, 離心,送四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(creatinine, Cr)和血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)的水平,取部分左側(cè)腎置于-80 ℃冰箱保存,用于Western blot蛋白檢測(cè),其剩余腎組織置于10%的多聚甲醛以便利用HE染色觀察腎臟病理形態(tài)。
1.2.3HE染色組織學(xué)檢查 將多聚甲醛固定的腎臟組織行石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化,損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[6]。并按照試劑盒說明書利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)染色檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡,具體步驟參見說明書。
1.2.4Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá) 取-80 ℃冰箱保存的腎組織,按照試劑后說明書提取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和總蛋白。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,然后上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育一抗[Cleaved-Caspase3抗體(1 ∶500),Caspase3抗體(1 ∶1 000), Cleaved-Caspase9抗體(1 ∶500),Caspase9抗體(1 ∶1 000), Bax抗體(1 ∶500), BCL-2抗體(1 ∶500), CytC抗體(1 ∶500) 和β-actin抗體(1 ∶3 000)],然后在4 ℃冰箱孵育過夜。洗滌, 37 ℃孵育二抗(IgG)1 h,洗滌,利用ECL顯影劑顯影,Bio-Rad成像并分析灰度值,具體步驟參考說明書和文獻(xiàn)[7]。
1.2.5線粒體的提取和線粒體膜電位測(cè)定 按照試劑盒說明書提取腎臟線粒體和檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm),單位為毫伏(mv),具體步驟參見說明書。
1.2.6腎臟活性氧(ROS)含量和ATP酶活性 提取腎組織勻漿按照試劑盒說明書檢測(cè)ROS含量和ATP酶活性。
2.1蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎功能的影響與Sham組相比,RIRI組血清中Cr和BUN表達(dá)量明顯增加(P<0.05);與RIRI組相比,Osthole組Cr和BUN表達(dá)量明顯降低(P<0.05),提示蛇床子素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,見表1。
表1 蛇床子素對(duì)Cr和BUN影響
與Sham組比較:***P<0.001;與Osthole組比較:#P<0.05
2.2蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟病理形態(tài)影響RIRI組與Sham組相比,腎小管明顯擴(kuò)張,管腔大量阻塞,腎小管大量壞死、脫落、大量蛋白管型、腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤;與RIRI組相比,Osthole組腎小管擴(kuò)張、管腔阻塞、壞死、脫落、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤均明顯減少,具體損傷評(píng)分見圖1。提示蛇床子素可減少腎臟病理損傷。
2.3蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟線粒體膜電位的影響與Sham組相比, RIRI組線粒體膜電位(ΔΨm)明顯降低(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比, 線粒體膜電位(ΔΨm)明顯增高(P<0.05)。提示蛇床子素可增加線粒體膜電位,見圖2。
圖1HE染色檢測(cè)蛇床子素對(duì)腎臟病理形態(tài)的影響×200
A:Sham組;B:RIRI組;C:Osthole組;與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
圖2 流式檢測(cè)蛇床子素對(duì)線粒體膜電位影響
與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
2.4蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟ROS含量影響與Sham組相比,RIRI組ROS含量明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比,ROS含量明顯降低(P<0.05)。提示蛇床子素可減少ROS含量,見圖3。
圖3 熒光分光光度法檢測(cè)蛇床子素對(duì)ROS含量的影響
與Sham組比較:**P<0.01;與RIRI組比較:#P<0.05
2.5蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟線粒體ATP酶活性影響與Sham組相比, RIRI組ATP酶活性明顯降低(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比,ATP活性明顯升高(P<0.05),見圖4。提示蛇床子素可增加線粒體ATP酶活性。
2.6蛇床子素對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟凋亡信號(hào)通路的激活與Sham組相比, RIRI組Cleaved-Caspase9和 Cleaved-Caspase3表達(dá)均明顯增高(P<0.05),而Caspase9和Caspase3表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。而Osthole組與RIRI組相比,Cleaved-Caspase9和 Cleaved-Caspase3表達(dá)均明顯降低(P<0.05),而Caspase9和Caspase3表達(dá)均明顯增高(P<0.05), 見圖5。提示蛇床子素可抑制凋亡信號(hào)通路的激活。
圖4 ATP酶法檢測(cè)蛇床子素對(duì)ATP活性的影響
與Sham組比較:*P<0.05;與RIRI組比較:#P<0.05
圖5 Western blot 檢測(cè)蛇床子素對(duì)Caspase9、Cleaved-Caspase9、Cleavaed-Caspase3和Caspase3 蛋白表達(dá)的影響
1:Sham組;2:RIRI組;3:Osthole組;與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
2.7蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響與Sham組相比,RIRI組BCL-2表達(dá)明顯降低 (P<0.05),而Bax表達(dá)明顯增高(P<0.05)。而Osthole組與RIRI組相比,BCL-2表達(dá)明顯增高(P<0.05),而Bax表達(dá)明顯降低(P<0.05), 見圖6。提示蛇床子素可減少凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。
2.8蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟細(xì)胞質(zhì)CytC表達(dá)影響與Sham組相比,RIRI組胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比,胞質(zhì)中CytC表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖7。提示蛇床子素可減少細(xì)胞質(zhì)CytC的表達(dá)。
1:Sham組;2:RIRI組;3:Osthole組;與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
2.9蛇床子素對(duì)RIRI大鼠腎臟凋亡細(xì)胞表達(dá)影響與Sham組相比,RIRI組TUNEL表達(dá)水平明顯增高(P<0.05); 而Osthole組與RIRI組相比,TUNEL表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖8。提示蛇床子素可減少細(xì)胞凋亡。
圖7 Western blot檢測(cè)蛇床子素對(duì)細(xì)胞質(zhì) CytC蛋白表達(dá)的影響
與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
線粒體是胞內(nèi)能量合成和儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所, 對(duì)缺血缺氧刺激特別敏感[ 8]。機(jī)體在正常生理狀況下, 通過線粒體代謝途徑消耗了90%以上的氧, 但其中2%的氧氣未能完全還原, 而是與呼吸鏈底物端逸出的電子結(jié)合生成超氧陰離子等ROS。因此線粒體是胞內(nèi)ROS生成的主要場(chǎng)所, 正常情況下,機(jī)體有完善的線粒體防御體系,體內(nèi)ROS處于生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡中, 不損傷線粒體以及機(jī)體[8]。腎缺血時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)被破壞,有氧氧化受阻, 線粒體ATP產(chǎn)生不足, 恢復(fù)血液再灌注時(shí)血超氧化物陰離子等明顯增強(qiáng),導(dǎo)致ROS表達(dá)明顯增多,超過了機(jī)體ROS的清除能力,過量的ROS損害線粒體的抗氧化應(yīng)激以及自由基清除酶系統(tǒng), 導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生, 形成惡性的循環(huán),導(dǎo)致過量的ROS蓄積[9]。而過量的ROS可攻擊線粒體,引起線粒體膜結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)的降低和促凋亡蛋白Bax表達(dá)的增加以及Bax/BCL-2比率的上調(diào)。而Bax/BCL-2比值的上調(diào)可促進(jìn)Bax與維生素B8(腺嘌呤核苷酸)的轉(zhuǎn)位酶相結(jié)合,導(dǎo)致ΔΨm的減少和線粒體膜通道孔(MPTP)的大量開放,進(jìn)而引起CytC等多種細(xì)胞蛋白從線粒體遷徙入胞質(zhì)。進(jìn)入胞質(zhì)的CytC與胞質(zhì)中的凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)結(jié)合可引起Caspase9的激活,而激活的Caspase9(Cleaved-Caspase9)可通過Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)Caspase-3激活,激活的Caspase-3(Cleaved-Caspase3)可促進(jìn)下游的DNA 依賴性蛋白激酶裂解,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[9-12]。在本研究中腎臟缺血45 min,再灌注24 h后Cr、BUN、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9、Bax、ROS、線粒體胞質(zhì)中AIF和CytC表達(dá)水平和腎組織病理改變以及TUNEL表達(dá)水平均明顯增加,而Caspase3、Caspase9和BCL-2的表達(dá)水平以及線粒體膜電位和ATP酶的活性均明顯減少。這與既往研究[9]結(jié)果相一致。
圖8TUNEL檢測(cè)蛇床子素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響×200
A:Sham組;B:RIRI組;C:Osthole組;與Sham組比較:***P<0.001;與RIRI組比較:#P<0.05
藥理學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)蛇床子素可通過抑制線粒體途徑減輕腦缺血再灌注損傷并具有清除ROS的作用。本實(shí)驗(yàn)選用蛇床子素(40 mg/kg)對(duì)RIRI及線粒體凋亡信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示蛇床子素預(yù)處理可減輕血清Cr和BUN的表達(dá),減少腎臟病理結(jié)構(gòu)改變,進(jìn)一步證實(shí)了蛇床子素對(duì)RIRI有保護(hù)作用。對(duì)其與線粒體凋亡信號(hào)通路的關(guān)系深入研究發(fā)現(xiàn),蛇床子素預(yù)處理可減少Cleaved-Caspase9、Cleaved-Caspase3、Bax、ROS、TUNEL以及線粒體胞質(zhì)中AIF和CytC的表達(dá)水平,但可明顯增加Caspase3、Caspase9和BCL-2的表達(dá)水平,線粒體膜電位和ATP酶的活性。其作用機(jī)制可能為蛇床子素可通過減輕線粒體腫脹和結(jié)構(gòu)的改變,促進(jìn)線粒體有氧氧化代謝途徑,增加ATP的生成和ROS的清除能力,從而減少Bax與維生素B8的結(jié)合,促進(jìn)ΔΨm的升高和抑制MPTP開放,導(dǎo)致CytC遷徙和與AIF相結(jié)合的減少以及Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活受阻,進(jìn)而減少Caspase下游的DNA依賴性蛋白激酶的裂解,腎臟細(xì)胞凋亡乃至腎功能受損。
綜上所述,蛇床子素可通過減輕RIRI后ROS介導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)改變而減少線粒體內(nèi)CytC 的釋放,并抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活,減輕缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡,保護(hù)受損腎臟細(xì)胞,這可能是蛇床子素抗腎臟缺血再灌注腦損傷的機(jī)制之一。
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2018年11期