中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中結(jié)腸小袋纖毛蟲快速鑒定及感染調(diào)查

高正琴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

新出現(xiàn)的原生動(dòng)物病原體已經(jīng)成為人類健康的主要威脅。在過去的二三十年里，導(dǎo)致人類疾病的原生動(dòng)物病原體的數(shù)量一直在上升。免疫缺陷患者數(shù)量的顯著增加、國(guó)際旅行的增加、森林砍伐和廣泛的城市住所是導(dǎo)致原生動(dòng)物疾病流行病學(xué)變化的一些因素。結(jié)腸小袋纖毛蟲是引起痢疾的重要原因，特別是在免疫系統(tǒng)受損的人群中，結(jié)腸小袋纖毛蟲可能成為一種重要的病原體。結(jié)腸小袋纖毛蟲(balantidiumcoli)寄生于宿主結(jié)腸，感染引起結(jié)腸小袋纖毛蟲病(balantidiosis)，呈世界性分布，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大多數(shù)人類病例都來自南美和中美洲、中國(guó)、伊朗、印度尼西亞、菲律賓、新幾內(nèi)亞和太平洋島嶼。目前已知包括人在內(nèi)的多種動(dòng)物如豬、猩猩、猴、大鼠、豚鼠、馬、牛、羊、鴕鳥、鷹等均可感染，感染的范圍從無癥狀、輕微腹瀉到血糞和暴發(fā)性痢疾。在急性疾病中，可能每20 min就發(fā)生一次暴發(fā)性腹瀉。在極少數(shù)情況下，結(jié)腸小袋纖毛蟲也會(huì)侵犯其他器官，這在免疫缺陷患者中更常見[1～12]。

目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染概況在很大程度上是未知的。至今尚未見不同方法檢定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲的具體研究及感染報(bào)道。本研究首次采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)(real-time dynamic microscopy technique)和聚合酶鏈反應(yīng)(polymeras chain reaction，PCR)及測(cè)序技術(shù)(sequencing technique)，對(duì)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)腸小袋纖毛蟲進(jìn)行快速檢定和感染調(diào)查，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年12月～2017年12月，14 964只表觀健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括：猴382只，小型豬725只，犬806只，兔1 517只，地鼠422只，豚鼠1 545只，大鼠1 489只，小鼠8 053只，雞25只)來自全國(guó)60個(gè)不同廠家。猴、小型豬、犬、兔、雞采集新鮮糞便。豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠安樂死后采集腸道內(nèi)容物[13，14]。

1.2 試劑和儀器 QIAamp DNA Stool Mini Kit，QIAamp DNA Mini Kit為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品；nuclease-free water為美國(guó)Progema公司產(chǎn)品；DNA Marker，Agarose，EX Taq，dNTP Mixture為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。顯微鏡及成像系統(tǒng)(Nikon，日本)；Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)(東樂自然基因生命科學(xué)公司)；Verity 96 Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystyem，美國(guó))；生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))。

1.3 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸小袋纖毛蟲 在生物安全柜內(nèi)，用生理鹽水將待測(cè)糞便、腸內(nèi)容物做適當(dāng)處理，吸取混懸液滴片，采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)檢測(cè)樣本中寄生蟲病原體。根據(jù)蟲體的形態(tài)和大小來進(jìn)行蟲種的鑒定。

1.4 引物設(shè)計(jì)和DNA提取 本研究針對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer ITS)，18S rRNA和SSU RNA(small subunit ribosomal RNA)基因區(qū)域，設(shè)計(jì)三對(duì)引物見表1。用QIAamp DNA Mini Kit提取結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體和包囊DNA。用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取糞便和腸內(nèi)容物樣本DNA。

表1結(jié)腸小袋纖毛蟲PCR引物序列

1.5 PCR和測(cè)序鑒定結(jié)腸小袋纖毛蟲 經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的研究摸索建立并優(yōu)化PCR檢測(cè)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行敏感度和特異度試驗(yàn)并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)際樣本中結(jié)腸小袋纖毛蟲檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系如下：5.0 μl 10×Buffer (Mg2+Plus)，4.0 μl dNTP Mixture，各0.5 μl上下游引物，0.25 μl EX Taq，2.0 μl模板DNA，用無核酸酶水(nuclease-free water)補(bǔ)足至50 μl。循環(huán)參數(shù)：95℃1 min 1 cycle；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，40 cycles；72℃10 min 1 cycle。PCR結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠成像分析系統(tǒng)攝錄試驗(yàn)結(jié)果。陽性樣本測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸小袋纖毛蟲結(jié)果 可見少量巨大的卵形或橢圓形纖毛蟲滋養(yǎng)體，不停地快速旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，無色透明或淺灰略帶綠色，大小為(30～200)μm ×(25～120)μm，腹面略扁平，背面隆起，表面凹凸不平，體表完全覆蓋著纖毛形成密集的縱向行，蟲體前端有胞口和胞咽，后端有胞肛，中后部有伸縮泡，細(xì)胞質(zhì)中含有許多食物顆粒及大小不等的食物泡，有腎形大核和圓形小核(圖1-A)。在一些滋養(yǎng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有許多內(nèi)在生物，內(nèi)在生物形態(tài)不規(guī)則，長(zhǎng)度可達(dá)5 μm，能夠從蟲體壁形成囊泡而釋放到外界(圖1-B)。包囊近圓形或卵圓形，淡黃或淡綠色，直徑為40～60 μm，外被兩層囊膜，囊壁稍厚，囊內(nèi)結(jié)構(gòu)同滋養(yǎng)體，唯食物泡少；新形成的包囊內(nèi)可見蟲體仍能活動(dòng)(圖1-C)。依據(jù)纖毛蟲滋養(yǎng)體和包囊的大小和形態(tài)特征，鑒定為結(jié)腸小袋纖毛蟲。應(yīng)用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲，結(jié)果從14 964份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本分離鑒定獲得4份結(jié)腸小袋纖毛蟲活體陽性樣本，陽性檢出率為0.03%。

圖1 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體和包囊鏡檢形態(tài)(A，B：滋養(yǎng)體；C：包囊)

2.2 PCR和測(cè)序鑒定結(jié)腸小袋纖毛蟲結(jié)果 將實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)檢出的結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體和包囊，提取DNA做PCR檢測(cè)，結(jié)果在單個(gè)滋養(yǎng)體和包囊DNA樣本中，均可檢出結(jié)腸小袋纖毛蟲基因ITS(300 bp)，18S rRNA(354 bp)和SSU RNA(255 bp)特異性目的片段。將測(cè)序鑒定的陽性樣本基因序列實(shí)時(shí)遞交NCBI，通過BLAST在線比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中結(jié)腸小袋纖毛蟲ITS，18S rRNA和 SSU RNA基因序列與GenBank中已公布的不同國(guó)家不同物種來源的結(jié)腸小袋纖毛蟲ITS，18S rRNA和 SSU RNA核苷酸同源性達(dá)99%～100%(GenBank登錄號(hào)為JN985904.1，AF045030.1，GQ903678.1，AY898942.1，AF029763.1)。應(yīng)用PCR和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)14 964份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)際樣本中結(jié)腸小袋纖毛蟲，結(jié)果檢出4份陽性樣本，陽性檢出率為0.03%。這4份陽性樣本均來自于豚鼠(表2)。

表2中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中結(jié)腸小袋纖毛蟲感染情況

注：a) 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)(real-time dynamic microscopy technique)；b) PCR和測(cè)序技術(shù)(PCR and sequencing technique)。

3 討論

感染性腸胃炎(infectious gastroenteritis，IGE)是由大量的細(xì)菌、病毒和寄生蟲引起的。腸道寄生蟲感染發(fā)生在世界上被邊緣化、低收入和資源受限的地區(qū)，在非洲、亞洲和美洲的發(fā)展中地區(qū)有超過10億的感染者。地球上大約有15 000個(gè)原生動(dòng)物物種。結(jié)腸小袋纖毛蟲是一種原生動(dòng)物，它可以導(dǎo)致人類、豬和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的痢疾，是一種人獸共患病病原體。結(jié)腸小袋纖毛蟲是人體最大的寄生原蟲。該蟲1857年首先由Malmsten[15]在兩名痢疾病人的糞便中發(fā)現(xiàn)，定名為結(jié)腸草履蟲(Parameciumcoli)。接著，Leukart[16]在豬的結(jié)腸中也有發(fā)現(xiàn)。1862年Stein[17]認(rèn)為前兩人所見為同一種，更名為結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantidiumcoli)。結(jié)腸小袋纖毛蟲生活史分滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)發(fā)育階段。包囊在宿主的結(jié)腸和直腸中開始形成，通常在形成的糞便中發(fā)現(xiàn)包囊。包囊是病原體的傳播階段。包囊壁厚不易受干燥和其他環(huán)境壓力的影響。包囊在免受陽光直射潮濕的環(huán)境中生存最好。被感染性包囊污染的空氣、水、食物、水果、蔬菜可造成感染傳播。結(jié)腸小袋纖毛蟲包囊被宿主吞食后，在胃腸道中受消化液的作用，包囊內(nèi)的蟲體脫囊而轉(zhuǎn)化為滋養(yǎng)體，并下行至結(jié)腸內(nèi)定居。滋養(yǎng)體以淀粉、細(xì)菌、腸壁細(xì)胞等為食，主要以橫二分裂法進(jìn)行繁殖。結(jié)腸小袋纖毛蟲感染在人類中并不常見。這種有機(jī)體雖然具有致病性，但毒性較低。以下三種臨床表現(xiàn)為：①輕度感染：導(dǎo)致間歇性腹瀉與便秘；②急性感染：滋養(yǎng)體攻擊腸道上皮，造成潰瘍和引起血痢類似于阿米巴痢疾，可能會(huì)有頭痛、發(fā)燒、惡心、嘔吐、腹痛和腸道絞痛。在少數(shù)病例中，可能發(fā)生腸穿孔性潰瘍，導(dǎo)致嚴(yán)重脫水、大出血休克甚至死亡；③慢性感染：間歇性腹瀉與便秘交替發(fā)生，糞便中含有大量的黏液，但很少有血液。免疫抑制、長(zhǎng)期有其他慢性疾病(如糖尿病、慢性腎病)、營(yíng)養(yǎng)不良或腸道正常機(jī)能發(fā)生改變時(shí)，結(jié)腸小袋纖毛蟲則易于侵入組織并發(fā)病。感染者腸道內(nèi)的菌叢組成對(duì)該蟲的寄生或致病也具有一定影響，Ros-tkawska觀察發(fā)現(xiàn)變形桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等對(duì)該蟲的發(fā)育產(chǎn)生有害作用；而肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌及腸桿菌等則有促進(jìn)作用。結(jié)腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體可分泌透明質(zhì)酸酶及借助纖毛運(yùn)動(dòng)能侵及人體的多種臟器，如肝臟、肺、泌尿生殖道、闌尾等器官，引起肝膿腫、壞死性肺感染、子宮陰道炎癥、尿路感染、膀胱炎、腹膜炎，侵犯腸黏膜甚至黏膜下層，引起潰瘍。主要病變部位是盲腸和直腸，可延及全部結(jié)腸黏膜，偶爾也可侵及回腸末端。嚴(yán)重病例可出現(xiàn)大面積結(jié)腸黏膜的破壞和脫落[18～32]。

LI等[33]2013年5月檢出中國(guó)廣西壯族自治區(qū)籠養(yǎng)的120只恒河猴(macaca mulatta)糞便結(jié)腸小袋纖毛蟲陽性率為64.2%(77/120)，據(jù)推測(cè)，在這個(gè)非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中心，有下列因素導(dǎo)致了恒河猴的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染：①未受感染的猴子從同一籠子里的陽性猴子糞便中攝取了包囊；②水和/或食物被貓或鼠的糞便所污染；③人類和猴子之間的交叉感染。Hinde[34]收集了加勒比海靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中心46只圈養(yǎng)的恒河猴乳汁，研究發(fā)現(xiàn)：沒有感染結(jié)腸小袋纖毛蟲的母猴體內(nèi)脂肪含量明顯高于有結(jié)腸小袋纖毛蟲感染的母猴體內(nèi)脂肪含量，結(jié)果表明母猴結(jié)腸小袋纖毛蟲感染和乳汁脂肪之間的聯(lián)系顯著。Tatfeng[35]對(duì)234只被困在不同地點(diǎn)(廁所、客廳、廚房和臥室)的蟑螂進(jìn)行細(xì)菌、真菌和寄生蟲分離，結(jié)果分離獲得了結(jié)腸小袋纖毛蟲、蛔蟲、鞭蟲、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、念珠菌、曲霉菌等病原體，因此，控制蟑螂將大大減少病原體在環(huán)境中的傳播。Rivera等[36]從墨西哥30名隨機(jī)挑選的女性齲齒患者的口、鼻和咽部檢出了結(jié)腸小袋纖毛蟲、溶組織內(nèi)阿米巴等原蟲。這些無癥狀攜帶者可傳播此類原蟲。Drakulovski等[37]在喀麥隆43只猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)陽性和71只SIV陰性的野生黑猩猩糞便中檢出了結(jié)腸小袋纖毛蟲、溶組織內(nèi)阿米巴、邁氏唇鞭毛蟲、縮小膜殼絳蟲等寄生蟲，這些高水平的寄生蟲感染可能會(huì)給在血液中存在大量SIV病毒的動(dòng)物群帶來額外的負(fù)擔(dān)。Kouassi等[38]報(bào)道科特迪瓦白眉猴的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染率為60.3%。Ryan等[39]報(bào)道加納狒狒的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染率為62%。Yaghoobi等[40]報(bào)道伊朗野豬的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染率為64%。目前，國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)腸小袋纖毛蟲監(jiān)測(cè)分析的報(bào)道，用不同方法快速檢測(cè)鑒定該病原體的研究信息更少。因此，本研究調(diào)查分析了不同種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的結(jié)腸小袋纖毛蟲，識(shí)別了此寄生蟲，填補(bǔ)了這一研究空白。本次調(diào)查中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)腸小袋纖毛蟲感染率為0.03%。綜上所述，本研究對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲進(jìn)行了感染調(diào)查和分子診斷。應(yīng)用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微技術(shù)跟蹤監(jiān)測(cè)寄生蟲，使用PCR結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)從分子水平上對(duì)結(jié)腸小袋纖毛蟲進(jìn)行確認(rèn)，為快速準(zhǔn)確鑒別診斷結(jié)腸小袋纖毛蟲感染提供新的思路。