風濕寧膠囊大孔樹脂純化工藝研究△

王鵬飛，劉培，葉花，王科，王嘉琛，段秀俊

（山西中醫(yī)藥大學，山西 榆次 030600）

風濕寧膠囊由青風藤、羌活、獨活、川芎等藥味組成，在治療風寒濕邪，痹阻經絡所致類風濕性關節(jié)炎，風濕性關節(jié)炎等方面療效明顯。大孔樹脂現(xiàn)已廣泛用于天然藥物的分離與精制，近年來也逐步應用于中藥復方制劑的工藝純化處理[1-2]，本實驗主要探討大孔樹脂純化風濕寧膠囊水提醇沉液的工藝條件，為風濕寧膠囊的制劑開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex高效液相色譜儀，PDA-100 Photodiode Array Detector檢測器，Chromeleon 6色譜工作站；Bs2245型分析天平，KQ-500型超聲波清洗儀，層析柱（Φ1.5 cm×30 cm）。

1.2 試藥

青藤堿對照品（批號：0774-200206，供含量測定用）購自中國食品藥品檢定研究院。大孔樹脂D101，購自天津光復精細化工研究所；大孔樹脂NAK-9、X-5、HPD-100，購自陜西樂博生化科技有限公司；大孔樹脂S-8，購自山東西亞化學工業(yè)有限公司。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 青藤堿的測定

參照文獻方法[1-4]，取提取物約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20 mL，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，制備供試品溶液。精密稱取干燥至恒重的青藤堿對照品加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液的對照品溶液。分別精密吸取上述兩種溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%三 胺（35∶65），檢測波長262 nm；柱溫30℃（見圖1）。

圖1 風濕寧膠囊青藤堿測定液相色譜圖

2.2 大孔樹脂精制純化工藝條件的考察

2.2.1 樹脂的預處理 取新購大孔吸附樹脂（D-101型、NKA-9型、S-8型、X-5型、HPD-100型），分別用95%乙醇浸泡數(shù)天后，依次用95%乙醇、純水、5%HCl，5%Na0H、純水沖洗備用[7-8]。

2.2.2 吸附條件考察

2.2.2.1 大孔樹脂的篩選 稱取處理好的5種型號樹脂各5 g，置100 mL錐形瓶中，加入藥液約70 mL，靜置24 h，不時振搖。將樹脂和藥液一起全部裝層析柱，藥液自然洗脫，收集所有洗脫液。測定吸附前后藥液中青藤堿含量，計算5種樹脂的吸附量，結果見表1。

表1 不同型號樹脂飽和吸附量比較

結果表明，D-101型大孔樹脂的飽和吸附量最大，吸附性能最好，1 g樹脂可以吸附6.308 4 g的藥材，因此確定使用D-101型大孔樹脂。

2.2.2.2 上樣濃度的考察 取醇沉藥液，濃縮后分別用純水調至每1 mL藥液相當于1 g原藥材的濃度，即1∶1，同法制得濃度為 3∶1，5∶1，7∶1的上樣液，分別上樣，控制流速為7 d·min－1，收集洗脫液，測定原液與洗脫液中青藤堿含量，計算4個濃度藥液的樹吸附量，結果見表2。

表2 上樣濃度考察結果

從實驗結果看藥液濃度為1∶1吸附效果最好。

2.2.2.3 上樣流速考察 固定上樣液的濃度為1∶1，分別以1、2、3、4 BV·h－1的流速上樣，收集洗脫液，測定原液與洗脫液中青藤堿含量，計算不同流速下的樹吸附量，結果見表3。

表3 不同上樣流速吸附的考察

由實驗結果來看，樹脂對青藤堿的吸附能力極強。1 BV·h－1的流速能夠得到最大的吸附量。

2.2.2.4 上樣量的確定（吸附量泄露的考察） 使用醇沉液配制100 mL一定濃度的上樣液，以1 BV·h－1的流速上樣已裝柱的經處理的樹脂，每5 mL收集樣品一份。選擇第 1、4、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、20份洗脫液，各取 2 mL，用70%乙醇定容至25 mL，由0.45μL的濾頭過濾，取續(xù)濾液，進行含量測定。以流出液的體積為橫坐標，以指標性成分的含量為縱坐標繪制動態(tài)吸附曲線，見圖2。

圖2 泄露曲線

由泄露曲線可得，從第9份樣品開始泄露，飽和上樣量為45 mL，相當于1g樹脂可吸附6.848 g的原藥材。

2.2.3 洗脫條件的考察

2.2.3.1 洗脫溶劑的選擇 取經處理的樹脂4份，各5 g，考察不同洗脫劑濃度對洗脫的影響。將1∶1的上樣液以1 BV·h－1的流速上樣后，先用約100 mL的純水洗脫，水液棄去不用。再分別用濃度為30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，收集洗脫液，調整濃度后，進行含量測定。按公式（1）計算回收率[9-11]。結果見表 4。

表4 不同濃度洗脫劑的洗脫效果比較

由結果來看，50%乙醇的洗脫量最大，洗脫效果最好，確定使用。

2.2.3.2 洗脫流速的考察 用最佳吸附條件飽和吸附后，經純水洗脫，相同體積的50%乙醇分別以1、3、4、5 BV·h－1的流速洗脫，收集洗脫液，對洗脫液中的青藤堿進行測定，同2.2.3.1計算，結果見表5。

表5 洗脫流速的考察

從表5得出，隨著流速增大，洗脫效果降低，但 1 BV·h－1與 2 BV·h－1的洗脫流速對洗脫效果影響不大，但2 BV·h－1的洗脫流速可節(jié)約一半的時間，極大地提高了工作效率，所以選擇2 BV·h－1洗脫。

2.2.3 洗脫劑用量的考察 水洗飽和吸附的樹脂后，用100 mL的50%乙醇以1 BV·h－1洗脫，每10 mL收集一份，共收集約10份，制備供試液，進行含量測定，計算結果做曲線圖如圖3。

圖3 洗脫液中的含量變化

為保證洗脫完全，洗脫液的量定為10 BV。

2.2.4 驗證試驗 按照試驗確定的吸附、洗脫的條件，進行驗證，測定青藤堿的回收率，平均值為98.83%。

2.2.5 樹脂使用次數(shù)的考察 為節(jié)約生產成本考察了大孔樹脂不經再生的重復使用次數(shù)，實驗連續(xù)使用六次，計算回收率，結果見表6。結果樹脂在前五次使用時回收率均不低于98.44%，第六次使用時回收率顯著降低至91.90%，表明樹脂至少可以使用5次[12-13]。

表6 樹脂使用次數(shù)的考察

3 討論

本實驗主要考察風濕寧膠囊的大孔樹脂純化工藝條件，實驗結果表明D-101型大孔樹脂對該制劑的吸附能力最強，上樣液濃度為1∶1，上樣流速為1 BV·h－1，上樣量為1 g樹脂折合原生藥6.848 g，洗脫溶劑為50%的乙醇，洗脫流速為2 BV·h－1，洗脫量為10 BV；樹脂至少可重復使用5次。

大孔樹脂多用于單味中藥的分離純化，風濕寧膠囊由17味中藥組成，采用傳統(tǒng)的水提醇沉淀方法處理后服用量仍然較大，故實驗設計將水提醇沉液進行大孔樹脂純化處理，并對其純化工藝條件展開了系統(tǒng)研究。項目組曾考察了水煎煮、水提醇沉、水提醇沉大孔樹脂處理三種工藝路線制備樣品的抗炎止痛效果，結果無顯著性差異，說明不管是醇沉淀還是大孔樹脂吸附均未對藥效成分的提取量及藥效結果造成明顯影響，說明風濕寧膠囊采用大孔樹脂純化處理具有較強可行性。

風濕寧膠囊雖然所含藥味較多，但多數(shù)藥味或因其所含成分水煎煮之后檢出率低，或在多味中藥中共存等，均不適于作為工藝考察的指標，實驗選擇了轉移率較高的青藤堿作為工藝考察指標。

大孔樹脂純化是基于其吸附和篩選作用，洗脫較容易，因此用水或低體積分數(shù)乙醇預洗除雜時應考察其用量，以免目標成分的損失。經考察，風濕寧膠囊采用10 BV純水預洗除雜基本未造成目標成分的損失。