利用AFLP技術(shù)檢測(cè)外源總DNA導(dǎo)入鯽的研究

閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

關(guān)于外源總DNA的導(dǎo)入技術(shù)在動(dòng)植物改良和新品種創(chuàng)建方面，已有一些研究。Guangyu-zhou[1]將外源總DNA導(dǎo)入棉花Gossypium spp和水稻Oryza sativa、Oryza glaberrima中改變了它們的遺傳性狀；丁明忠等[2]將大豆 Glycine max（Linn.）Merr總 DNA直接導(dǎo)入玉米Zea mays Linn.sp.中獲得優(yōu)質(zhì)高蛋白玉米；胡文明等[3]將玉米的總DNA導(dǎo)入小麥Triticum aestivum L.中，提供了新的種質(zhì)資源，有利解決小麥遺傳基礎(chǔ)狹窄問題；王德興等[4]將小麥總DNA導(dǎo)入向日葵Helianthus annuus選育自交系中，獲得了品質(zhì)優(yōu)良的新品種；閆學(xué)春等[5-7]利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)分別將中國對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis和河蟹Eriocheir sinens總DNA導(dǎo)入鯉Cyprinus carpio L.、鏡鯉 Cyprinus carpio L.mirror中，分別獲得了顯微介導(dǎo)中國對(duì)蝦基因鯉和顯微介導(dǎo)河蟹基因鏡鯉新品系；劉漢勤等[8]將鯽基因組DNA導(dǎo)入紅鯉 Cyprinus flammans（Richardson）的受精卵內(nèi)，成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因鯉新個(gè)體；梁明山等[9]將胡子鲇Clarias fuscus總DNA導(dǎo)入長吻Leiocassis longirostris中，使轉(zhuǎn)基因長吻得到了胡子鲇Osteichthyes、Siluriformes、Clariidae 的優(yōu)良性狀；向建國等[10]將鯉Cyprinuscarpio總DNA片段成功導(dǎo)入草魚Ctenopharyngodon idellus受精卵中，使轉(zhuǎn)基因草魚獲得了鯉的一部分遺傳性狀；朱新平等[11]成功將鯉基因組DNA導(dǎo)入鯪Cirrhina molitorella受精卵內(nèi)，對(duì)鯪進(jìn)行了遺傳改良，提高了鯪的耐寒性。

鯽Carassius auratus是我國傳統(tǒng)的鯉科淡水養(yǎng)殖魚類，具有易繁殖、養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn)。鱖Siniperca chuatsi（又名桂花魚等）肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有優(yōu)良的遺傳資源，利用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將鱖的基因組DNA導(dǎo)入鯽中，以改善鯽肉質(zhì)的可口程度。本研究將親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的鱖Siniperca chuatsi基因組DNA導(dǎo)入受體鯽中，通過擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）的檢測(cè)，目的是想要了解外源總DNA直接導(dǎo)入鯽是否有與導(dǎo)入鯉有同樣的效果，能否將這些有益的營養(yǎng)特性導(dǎo)入鯽，創(chuàng)造出新的鯽品種。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

試驗(yàn)用鱖購自哈爾濱市水產(chǎn)市場(chǎng)；試驗(yàn)用鯽取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。由黑龍江水產(chǎn)研究所遺傳育種與生物技術(shù)研究室制備顯微介導(dǎo)鱖基因鯽。

1.1.2 引物與試劑

DL2000（DNA Marker）購自大連寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶和T4 DNA連接酶購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司，尿素、AFLP接頭和引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。AFLP接頭及引物序列見表1。

1.1.3 鱖總DNA的制備

采用一次性無菌注射器在鱖的尾部提取血液0.1～0.2mL，其中加入 20～30μL到含有 800μL裂解液的離心管中，反復(fù)顛倒至混合均勻?yàn)橹埂?5℃水浴消化，待組織完全裂解后取出。加入2倍的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1混合液抽提2次，然后加入RNA酶（終濃度為 20μg/mL）37℃保溫 30min，再加入等體積的氯仿∶異戊醇=24∶1混合液抽提1次。最后加入2倍體積的冷凍無水乙醇沉淀，再用70%的冷凍無水乙醇洗滌沉淀1次，自然干燥后加入1/10 TE （Tris-HCl 0.02M，EDTA 0.02M，pH=8.0）溶解。再用物理方法打斷大片段DNA，將樣品DNA稀釋至終濃度為200ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 AFLP接頭及引物序列Tab.1 Adapter of AFLP and Primer sequence

1.1.4 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽DNA提取

試驗(yàn)魚DNA提取參見閆學(xué)春等[12]，剪取鰭條，放入裂解液中，55℃消化，酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混合液抽提，無水乙醇沉淀，TE溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 顯微注射

在當(dāng)年的4—6月鯽的繁殖期，選性成熟的親魚，經(jīng)人工催產(chǎn)后，采集其質(zhì)量高的卵子和精液。為有效利用魚卵和延長顯微注射時(shí)間，每次只從冰箱中取少量精、卵混合受精，剩余的精、卵存在4℃冰箱中保存。將鱖的總DNA用顯微注射器注射到鯽受精卵的核區(qū)附近，注射量在1nL左右。共導(dǎo)入鯽受精卵2 000余尾，獲得試驗(yàn)魚400尾，放入466.7m2池塘飼養(yǎng)（魚苗從平游到長成當(dāng)年魚種，依次投喂豐年蟲、大型浮游動(dòng)物、破碎料和顆粒飼料）。用這種方法保存的精、卵，可使用6～8小時(shí)，保證一天都能有充足的精、卵進(jìn)行導(dǎo)入外源基因研究工作。

1.2.2 AFLP雙酶切

酶切組合為Mse I/EcoR I，建立20μL反應(yīng)體系（10×NE Buffer4 2μL，BSA 0.2μL），37℃水浴酶切2h后，立即65℃滅活20 min。

1.2.3 AFLP接頭的制備和連接

用單鏈寡核苷酸制備雙鏈接頭，使Mse I接頭序列終濃度為50μM，EcoR I接頭序列終濃度為5μM。94℃變性，緩慢冷卻至10℃，退出PCR程序，完成雙鏈接頭的制備。

1.2.4 AFLP預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)

建立20μL預(yù)擴(kuò)增體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s，56℃1min，72℃1min，20個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

1.2.5 AFLP選擇擴(kuò)增反應(yīng)

將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用無菌去離子水或1/10 TE稀釋10倍作為選擇擴(kuò)增的模板。建立25μL選擇擴(kuò)增反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：94℃30s，65℃30s，72℃60s，13 個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0.7℃，94℃30s，56℃30s，72℃60s，23 個(gè)循環(huán)。

1.2.6 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

用6%的變性聚丙烯酰胺凝電泳檢測(cè)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。制膠，點(diǎn)樣，變性后的PCR選擇擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)5μL即可。待溴酚藍(lán)指示劑電泳出凝膠時(shí)結(jié)束電泳。采用Sanguinetti銀染法[13]進(jìn)行銀染，照相，分析。

1.2.7 目的條帶回收測(cè)序

將差異性條帶挖出轉(zhuǎn)移至0.5mL離心管中，加20μL 無菌水，65℃水浴 40min，12 000 r/min 離心10min，取以上清液作模板，用原來選擇擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，PCR程序與AFLP選擇擴(kuò)增程序相同，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用瓊脂糖電泳DNA回收試劑盒回收目的條帶回收，測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽基因組DNA提取結(jié)果

DNA定量分析儀測(cè)定表明，提取的顯微介導(dǎo)鱖基因鯽基因組DNA OD260/OD280均在1.8～2.0之間，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）也顯示DNA條帶清晰，可用于AFLP后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

圖1 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽基因組DNA瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Agarose electrophoresis of the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp genomic DNA

以鱖基因組DNA為陽性對(duì)照，以普通鯽基因組DNA為陰性對(duì)照。對(duì)118尾顯微介導(dǎo)鱖基因鯽的AFLP檢測(cè)表明，在15對(duì)AFLP引物中，有2對(duì)AFLP引物在48尾顯微介導(dǎo)鱖基因鯽中擴(kuò)增出了和外源鱖基因相同而對(duì)照鯽沒有的帶，陽性率為40.67%。圖2是其中的5對(duì)引物對(duì)部分顯微介導(dǎo)鱖基因鯽的AFLP擴(kuò)增電泳圖，箭頭所標(biāo)示的就是供體基因片段。其中引物E-ACA/M-CAC在1個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出5個(gè)供體基因片段，而引物E-AAC/M-CAG在2個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出10個(gè)供體基因片段。

圖2 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽E-ACA,M-CAC引物擴(kuò)增電泳Fig.2 Agarose electrophoresis of E-ACA and M-CAC primers amplification in the micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp

圖3 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽序列與鱖供體基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Sequence alignment of micro-injected exogenous Siniperca chuatsi gene crucian carp and donor Siniperca chuatsi

2.3 顯微介導(dǎo)鱖基因鯽目的條帶測(cè)序結(jié)果

為進(jìn)一步找到精確的遺傳證據(jù)，在AFLP試驗(yàn)結(jié)果中，對(duì)其中5尾陽性顯微介導(dǎo)鱖基因鯽擴(kuò)增出來的與外源供體鱖基因相同的帶，而鯽中沒有的條帶進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物濃度均為30ng/μL，經(jīng)瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，符合測(cè)序規(guī)格的樣品測(cè)序（圖3）。結(jié)果顯示，陽性顯微介導(dǎo)鱖基因鯽均含有供體基因目的片段。

3 討論

DNA分子標(biāo)記是直接反映種群或個(gè)體間基因組DNA間的差異，獲得差異特征的DNA片段。擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）標(biāo)記[14]可以快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定地得到來源于不同材料的DN A指紋圖譜[15]，可以掃描一個(gè)物種的全基因組，而不需要了解被研究物種的DNA序列。這是因?yàn)锳FLP標(biāo)記所顯示的限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性，是由選擇性擴(kuò)增基因組DNA酶切片段產(chǎn)生。在檢測(cè)基因組DNA時(shí)，這種多態(tài)性是以擴(kuò)增片段的長度不同而檢測(cè)出來，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50～100條之間，一次分析可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性極高，信息量大，產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目多，分辨率高，結(jié)果可靠，是快速檢測(cè)魚類基因組DNA的好方法。近年來，AFLP技術(shù)也逐漸用于檢測(cè)轉(zhuǎn)外源基因組DNA。姬生東等[16]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)導(dǎo)入外源玉米DNA的苜蓿Medicago sativa Linn，在苜蓿中篩選到差異條帶數(shù)，證明由離子束介導(dǎo)外源DNA導(dǎo)入可以引起受體苜?；蚪MDNA發(fā)生變異。閆學(xué)春等[5-7]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，在受體鯉（鏡鯉）中均檢測(cè)到來自供體中國對(duì)蝦（河蟹）基因組DNA，證明受體鯉（鏡鯉）中含有供體基因片段。本研究中，在顯微介導(dǎo)鱖基因鯽的AFLP指紋圖譜中擴(kuò)增出鱖基因片段，從分子水平上驗(yàn)證鱖基因已經(jīng)成功導(dǎo)入受體鯽中，隨后對(duì)這些目的DNA片段回收、克隆、測(cè)序，顯微介導(dǎo)鱖基因鯽的序列與鱖的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)堿基序列有高度的同源性，更進(jìn)一步驗(yàn)證鱖供體基因組已經(jīng)成功導(dǎo)入受體鯽中。檢測(cè)目的DNA序列是否源于鱖DNA，為顯微介導(dǎo)外源總DNA導(dǎo)入技術(shù)提供更確鑿的分子證據(jù)。

本研究采用顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，嘗試鱖基因組DNA與鯽基因組DNA的超遠(yuǎn)緣基因雜交，利用AFLP技術(shù)測(cè)出了顯微介導(dǎo)處理的鯽含有供體基因DNA片段。分析顯微介導(dǎo)鱖基因鯽的多態(tài)性，以期為顯微介導(dǎo)外源總DNA片段的導(dǎo)入，創(chuàng)制鯽新種質(zhì)技術(shù)提供理論數(shù)據(jù)。在AFLP實(shí)驗(yàn)中，對(duì)提取實(shí)驗(yàn)魚DNA的質(zhì)量要求很高，實(shí)驗(yàn)的成功率在很大程度上取決于模板DNA的純度，即AFLP成功的關(guān)鍵要有高純度的模板DNA[17]。在AFLP雙酶切實(shí)驗(yàn)步驟中，可以使酶切中的限制性內(nèi)切酶的活性發(fā)揮到最大化。高純度的模板DNA是關(guān)鍵，它可使酶切更加充分，酶切結(jié)果才更加符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求[18]。所以，在模板DNA的提取過程中必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，提取出符合實(shí)驗(yàn)要求的無蛋白質(zhì)和RNA雜質(zhì)污染的高純度模板DNA，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開展。

顯微介導(dǎo)鱖基因鯽是在鯽中導(dǎo)入了鱖的基因組DNA，兩個(gè)物種的雜交存在于基因組水平，而非傳統(tǒng)意義上的精卵細(xì)胞雜交。檢測(cè)表明，在受體魚中明顯出現(xiàn)供體的DNA片段，根據(jù)周光宇等[19]提出的DNA片段雜交假說，這種帶有部分親和的遠(yuǎn)緣物種的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因的雜交DNA片斷，即部分與母本同源的DNA片斷有可能重組進(jìn)入母本，使雜種性狀出現(xiàn)變異，說明這種基因組雜交的方法是可行的。目前，水產(chǎn)生物轉(zhuǎn)基因所需的優(yōu)異基因資源非常有限，這也是限制利用功能基因改善水產(chǎn)生物品質(zhì)的主要問題。孫曉波等[20]將辣椒Capsicum annuum L.花粉中高賴氨酸蛋白基因Cflr導(dǎo)入小麥Triticum aestivum L.中，檢測(cè)結(jié)果顯示陽性；朱吉等[21]的研究結(jié)果表明，湖南豬Sus原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白5基因（CMYA5）的多態(tài)性與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)；施培松等[22]開展了匙吻鱘Polyodon spathula脂肪酸合成酶（FAS）基因的克隆及FAS基因mRNA在魚不同組織肌肉中的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)在肝臟等10種組織中均檢測(cè)到FAS基因mRNA的表達(dá)，而在肝臟中的表達(dá)量最高；孫志鵬等[23]開展了鯉Cyprinus carpio L.脂肪酸合成酶基因的克隆與表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)FASN基因在鯉腦組織中表達(dá)量最高。隨著對(duì)水產(chǎn)生物品質(zhì)育種的逐漸重視，以及水產(chǎn)生物基因組測(cè)序和生物信息學(xué)在水產(chǎn)生物基因組結(jié)構(gòu)和功能研究的廣泛應(yīng)用，從與鯽品質(zhì)相關(guān)的功能基因方面研究顯微介導(dǎo)鱖基因鯽與普通鯽的不同，將有助于深入了解其肌肉品質(zhì)的差異和更加深入的認(rèn)識(shí)脂肪酸、氨基酸等一系列代謝過程[7]。至于影響鯽肌肉的品質(zhì)的基因，即鱖基因在受體鯽的精細(xì)調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。