綿馬貫眾不同萃取部位總間苯三酚含量的測(cè)定

劉計(jì)權(quán)，王菊平，曹天文，賀潤(rùn)麗

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西太原030024； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030006）

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨（Dryopteris crassirhizomaNakai）的干燥根莖及葉柄殘基。味苦，微寒，有小毒，歸肝、胃經(jīng)。具有清熱解毒、驅(qū)蟲的功效［1］?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，綿馬貫眾富含五十多種間苯三酚類化合物［2］，這些間苯三酚類化合物具有抗瘧［3］、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和殺血吸蟲［4-5］等功效。本文以間苯三酚為對(duì)照品，經(jīng)間苯三酚類成分的專屬性顯色劑堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液顯色［6］，采用可見分光光度法，測(cè)定了綿馬貫眾不同萃取部位總間苯三酚的含量。

1 儀器與試藥

Hitachi U-2000紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司）。間苯三酚對(duì)照品（上海時(shí)代生物科技有限公司，批號(hào) 100389-200301，純度＞99%），堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽（北京Solarbio科技有限公司生產(chǎn)）。綿馬貫眾藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)鑒定為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛厥（Dryopteris crassirhizomaNakai）的干燥根莖及葉柄殘基。

2 研究方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品間苯三酚0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇適量，置30℃水浴上微熱使溶解，冷卻后用70%乙醇定容至刻度，搖勻，制得1 mg/mL對(duì)照品母液。精密吸取1 mL對(duì)照品母液置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得0.01 mg/mL對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

用電子天平稱取過60目綿馬貫眾藥材粉末1 g，精密稱定，精密加入70%乙醇100 mL，稱重，回流提取1 h，冷卻至室溫，稱重、補(bǔ)重，混勻，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1 mL置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 顯色劑的配制

精密稱定堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽粉末0.5 g，置100 mL容量瓶中，加少量70%乙醇溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為0.5%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液。取適量上述溶液，并用蒸餾水稀釋分別制得0.3%、0.1%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL，分置10 mL具塞刻度試管中，用70%乙醇定容至2 mL，精密加入0.5%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液3 mL，放置10 min。于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描測(cè)定，測(cè)得對(duì)照品和供試樣品溶液絡(luò)合前后的差示吸收光譜均在476 nm處有最大的差示吸光度值，故選擇476 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

2.5 顯色條件考察

采用L9（34）正交試驗(yàn)表，以對(duì)照品對(duì)顯色劑濃度、顯色時(shí)間和顯色劑用量進(jìn)行顯色條件考察。顯色條件因素水平表見表1。

表1 顯色條件因素水平表

3 測(cè)定結(jié)果

3.1 顯色條件考察的正交試驗(yàn)結(jié)果

顯色條件考察的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2數(shù)值進(jìn)行直觀分析可以看出，各因素作用的主次為A＞C＞B，初步確定最佳顯色條件為A3B3C3。為進(jìn)一步明確各因素水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否具有顯著影響，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 顯色條件正交試驗(yàn)結(jié)果表

表3 顯色條件正交試驗(yàn)方差分析表

表3方差分析結(jié)果顯示，顯色劑濃度和用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響，而顯色時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性影響。從節(jié)省時(shí)間的角度考慮，確定最佳顯色條件為A3B1C3，即用0.5%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽溶液3 mL，室溫放置10 min顯色。

3.2 顯色穩(wěn)定性考察

精密量取對(duì)照品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按上述最佳顯色條件顯色后，繼續(xù)放置2 h，并每隔30 min測(cè)定1次吸光度。測(cè)定結(jié)果表明，顯色后的溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=1.76%.

3.3 顯色劑穩(wěn)定性考察

精密吸取對(duì)照品溶液2 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按上述最佳顯色條件顯色、測(cè)定，顯色劑配置后每隔2 h對(duì)對(duì)照品溶液顯色測(cè)定1次吸光度，測(cè)定結(jié)果表明，顯色劑在8 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=2.30%。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取已配制好的0.01 mg/mL的對(duì)照品溶 液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中并依次標(biāo)號(hào)，用70%乙醇稀釋至2 mL，按最佳條件顯色，以70%乙醇為空白，測(cè)定吸光度。

以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的取樣量（μg）為橫坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸得回歸方程y=0.049 2x+0.018 3，r=0.999 6，F(xiàn)=49.2＞F0.01（1，4）=21.2，回歸關(guān)系極顯著。結(jié)果表明對(duì)照品在2～12 μg之間顯色后吸光度值與對(duì)照品取樣量呈良好線性關(guān)系。

3.5 精密度試驗(yàn)

精密量取已配制好的對(duì)照品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，平行操作6份，按上述最佳條件定容顯色、測(cè)定，測(cè)得吸光度平均值為0.514，RSD=1.37%，表明顯色的精密度良好。

3.6 供試品溶液穩(wěn)定性考察

精密吸取供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按上述最佳條件定容顯色，繼續(xù)放置90 min，并每隔10 min測(cè)定1次吸光度。測(cè)定結(jié)果表明，供試品溶液顯色后在90 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=1.55%.

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取過60目綿馬貫眾藥材粉末6份，每份0.5 g，按上述方法配制供試品溶液，并以上述最佳顯色條件顯色、測(cè)定，測(cè)得總間苯三酚的平均含量為 10.03%，RSD=1.03%。測(cè)定結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知總間苯三酚含量（平均含量為10.03%）的綿馬貫眾藥材粉末約 0.045 g，平行操作6份，分別精密加入對(duì)照品溶液（1 mg/mL）4.5 mL，按上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并以上述最佳顯色條件顯色、測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果表明，平均回收率為99.76%，RSD=2.17%，該法加樣回收率良好。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

3.9 不同萃取部位總間苯三酚含量的測(cè)定

取綿馬貫眾藥材粉末按上述方法回流提取，提取物上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至稠膏狀，然后取1.113 g浸膏用適量蒸餾水溶解后，采用液-液分離法，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，經(jīng)過濃縮后制得石油醚部、氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的萃取物。萃取物經(jīng)干燥稱重后用70%乙醇稀釋，制備各萃取部位供試品溶液，以70%乙醇溶液作為空白，按上述最佳顯色條件顯色、測(cè)定吸光度，帶入回歸方程計(jì)算各萃取部位總間苯三酚的含量。測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 不同萃取部位總間苯三酚含量（n=3）

4 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綿馬貫眾總間苯三酚在不同萃取部位中的含量差異很大，在5個(gè)萃取部位中以氯仿萃取部位的總間苯三酚含量最高，其次為乙酸乙酯萃取部位，正丁醇萃取部位和石油醚萃取部位中的總間苯三酚含量較低，水萃取部位中不含有間苯三酚類化合物。

文獻(xiàn)報(bào)道，綿馬貫眾具有殺蟲、抑菌和抗病毒等作用，其中間苯三酚類化合物是其發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［2］。作者前期研究了綿馬貫眾不同萃取部位的殺線活性，研究結(jié)果表明，氯仿萃取部位的殺線活性最強(qiáng)（LC50=0.39 mg/mL），乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和石油醚萃取部位的殺線活性依次降低，水部萃取物的殺線活性最弱（LC50=1.85 mg/mL），綿馬貫眾不同萃取部位的殺線活性與各部位中總間苯三酚的含量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，即總間苯三酚的含量越高，其殺線活性越強(qiáng)［7］，后期在研究綿馬貫眾不同萃取部位防治黃芪白粉病和黃芪蚜蟲的實(shí)驗(yàn)中得到了相同的結(jié)論。

文獻(xiàn)報(bào)道以綿馬貫眾素ABBA為對(duì)照品對(duì)綿馬貫眾的總間苯三酚含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)得總間苯三酚類化合物的平均含量為10.90%［8］。本實(shí)驗(yàn)以間苯三酚為對(duì)照品對(duì)綿馬貫眾的總間苯三酚含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)得綿馬貫眾中總間苯三酚類化合物的平均含量為10.03%。兩種方法相比，測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確可行，而且對(duì)照品容易獲得。

在回流提取制備供試品溶液的實(shí)驗(yàn)中，考察了70%、80%和90%乙醇三種濃度的提取效果，測(cè)定結(jié)果顯示三種濃度提取對(duì)總間苯三酚的含量沒有顯著影響，從經(jīng)濟(jì)和節(jié)約的角度考慮，最后選用70%的乙醇作為適宜的提取溶劑濃度。