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    日本血吸蟲感染鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞分離條件的優(yōu)化及分離效果的流式檢測

    2018-11-05 04:37:10任丹丹夏媛媛王秀男沈際佳張玉俠
    關(guān)鍵詞:膠原酶血吸蟲流式

    任丹丹,夏媛媛,王秀男,劉 彪,李 強(qiáng),沈際佳,張玉俠

    在我國血吸蟲病仍是一個重大公共衛(wèi)生問題,嚴(yán)重影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1-2]。其主要危害是肝臟的蟲卵性肉芽腫炎癥和隨后的纖維化[3]。肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離、純化和檢測對研究蟲卵肉芽腫的細(xì)胞學(xué)及免疫學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。

    有相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道采用Ⅳ型膠原酶結(jié)合注射器機(jī)械吹打分離肉芽腫細(xì)胞,但并未提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟,而且尚無針對感染不通過階段(急、慢性期)分離肉芽腫細(xì)胞的優(yōu)化方案[4-7]。本研究結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,采用Ⅳ型膠原酶兩步消化法處理急、慢性血吸蟲感染小鼠肝臟,通過流式檢測肉芽腫細(xì)胞的主要成分以確定分離效果以獲得大量的及保存細(xì)胞表面標(biāo)志物的肉芽腫細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)。對膠原酶濃度及消化時(shí)間進(jìn)行調(diào)整,建立了分離急慢性肉芽腫細(xì)胞的有效方法。

    1 材料與方法

    1.1日本血吸蟲感染模型的建立 C57BL/6,6-8周齡的SPF級雄性小鼠購自南京模式動物研究所。日本血吸蟲陽性釘螺購自湖南省寄生蟲病防治研究所,以常規(guī)方法逸出尾蚴。C57/BL6小鼠腹部去毛,蓋玻片蘸取尾蚴(20±2條)貼于小鼠腹部。感染后6周或12周處死小鼠。

    1.2 肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離

    1.2.1脫頸處死小鼠后, 75%乙醇浸泡 3 min,無菌取出約1 g的肝臟放入青霉素瓶中。

    1.2.2加入100 μL下述不同濃度的Ⅳ型膠原酶溶液,眼科剪剪碎肝組織呈糊狀(約10 min)。

    1.2.35 mL的生理鹽水重懸剪碎的肝組織,待肉芽腫顆粒自然下沉即吸去渾濁上清,再加入生理鹽水重懸,并吸去上清,如此反復(fù)自然沉淀洗滌,直至上清清澈。

    1.2.4收集感染6周的肉芽腫顆粒加入50 mL錐形瓶中:再分別加入10 mL含Ca2+/Mg2+和5%的胎牛血清的0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.2 mg/mL的膠原酶溶液(Ⅳ型Solarbio),37 ℃搖床消化,210 r/min,30 min;300目細(xì)胞篩過濾,小鐵勺刮取細(xì)胞篩上的肉芽腫放入新錐形瓶中,再分別加入10 mL的上述濃度膠原酶溶液,37 ℃搖床消化,210 r/min,30 min。

    1.2.5將雛形瓶置于冰上3 min終止消化,倒入無菌皿中,加入適量的完全1640培養(yǎng)基,用5 mL注射器反復(fù)吹,直至肉芽腫顆粒消失,300目細(xì)胞篩過濾至50 mL離心管中,離心,1 500 r/min,5 min,4 ℃。

    1.2.6棄上清,加入5 mL紅細(xì)胞裂解液,冰上10 min,再加入10 mL的不完全1640終止裂紅,上下顛倒離心管混勻。離心,1 500 r/min,5 min,4 ℃,棄上清。不完全1640培養(yǎng)基離心洗滌2次,1 mL完全1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106~6×106個/mL,400目尼龍網(wǎng)過濾懸液以去除蟲卵,用于流式檢測。

    1.2.7膠原酶消化時(shí)間和濃度的調(diào)整:感染6周小鼠肝臟,先固定消化時(shí)間不變(兩步消化時(shí)間為30/30 min),改變膠原酶濃度(分別為0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL),37 ℃搖床,210 r/min進(jìn)行消化,獲取肉芽腫細(xì)胞,標(biāo)記抗體進(jìn)行流式檢測,結(jié)果表明0.25 mg/mL為最佳濃度。然后選擇0.25 mg/mL膠原酶濃度來設(shè)置不同的消化時(shí)間分別為30 min與30 min、40 min與20 min和30 min與20 min,并據(jù)流式結(jié)果確定最佳消化時(shí)間,感染12周小鼠肝臟,分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的酶溶液消化,兩次時(shí)間為40 min與30 min。

    1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測肉芽腫細(xì)胞 肉芽腫細(xì)胞5×106個/管,大鼠血清20 μL,室溫封閉20 min。加入1 μL FITC-CD4抗體/管(BD公司),4 ℃,避光孵育40 min。染色緩沖液洗滌,350 μL的流式固定液重懸、固定細(xì)胞。流式儀檢測。

    1.4天狼猩紅染色 留取肝臟組織,4%的多聚甲醛溶液固定24 h,浸臘、包埋,切片厚度5 μm,脫蠟至水,做常規(guī)天狼猩紅染色。

    1.5數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0 軟件包處理, 三組數(shù)據(jù)比較采用方差分析, 兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1肝臟的大體圖 感染6周的小鼠肝臟表面可見很多粟粒樣肉芽腫顆粒如圖1A,而感染12周的小鼠肝臟表面肉芽腫顆粒較多但較小,且肝臟顏色更深,呈深褐色見圖1B。

    A. 感染6周; B. 感染12周圖1 小鼠感染血吸蟲后病變肝臟Fig.1 Photography of livers in mice infected with S. japonicum

    2.2肝臟纖維化觀察 紅色為天狼猩紅所染的纖維化組織,感染6周的小鼠肝臟肉芽腫見圖2A,此時(shí)肝臟纖維化程度輕、面積較小;感染12周的肝臟,纖維化面積增大見圖2B。

    A. 感染6周; B. 感染12周圖2 小鼠感染血吸蟲后的肝臟纖維化(天狼猩紅染色, ×100)Fig.2 Hepatic fibrosis in mice infected with S. japonicum (Sirius red staining, ×100)

    2.3獲得干凈的肝臟肉芽腫及肉芽腫細(xì)胞 如圖3A、B所示,第一步膠原酶消化后獲得干凈的肉芽腫。鏡下可見大量圍繞蟲卵的肉芽腫細(xì)胞如圖3B。經(jīng)過第二步膠原酶消化后獲得干凈的活肉芽腫細(xì)胞見圖3C。

    A. 肉芽腫顆粒; B. 肉芽腫顆粒鏡下圖(×200); C. 肉芽腫細(xì)胞(×400)圖3 肝臟肉芽腫顆粒及肉芽腫細(xì)胞Fig.3 Hepatic granulomatous granules and cells

    2.4 流式檢測肉芽腫細(xì)胞

    2.4.1 感染6周的肝臟肉芽腫

    2.4.1.1膠原酶濃度的探索 分別采用0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL Ⅳ型膠原酶進(jìn)行消化,消化時(shí)間均為30 min /30 min,獲取肉芽腫細(xì)胞,標(biāo)記抗體后進(jìn)行流式檢測。結(jié)果表明,0.25 mg/mL酶溶液消化下,可獲得較高比例的CD4+T細(xì)胞且CD4+T細(xì)胞分群明顯如圖4A、B。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4C, *P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,選擇膠原酶最佳濃度為 0.25 mg/mL,用于探索消化時(shí)間。

    圖4 不同膠原酶濃度分離感染6周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.4 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

    2.4.1.2消化時(shí)間的優(yōu)化 在確定膠原酶最佳濃度為0.25 mg/mL后,調(diào)整消化時(shí)間為:30 min /30 min,30 min /20 min,40 min /20 min,粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞流式圖見圖5A。結(jié)果表明,在使用0.25 mg/mL的Ⅳ型膠原酶濃度條件下,第一次消化時(shí)間為30 min,第二次消化時(shí)間為20 min時(shí),CD4+T細(xì)胞分群最佳,但細(xì)胞比例較低,見圖5B;當(dāng)?shù)谝淮蜗瘯r(shí)間增加至40 min時(shí),可獲得更多CD4+T細(xì)胞,但CD4+T細(xì)胞分群不明顯,見圖5C;而當(dāng)兩次消化均為30 min時(shí),可獲得數(shù)量較多且分群明顯的CD4+T細(xì)胞。

    圖5 不同消化時(shí)間分離感染6周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.5 Effects of different digestion periods on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

    2.4.2流式檢測感染12周小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞的分離效果 血吸蟲感染小鼠隨著病情進(jìn)展,肝臟逐漸出現(xiàn)纖維化,由于大量膠原沉積,此時(shí)分離肉芽腫細(xì)胞應(yīng)該使用更高濃度的酶消化液,消化時(shí)間也應(yīng)適當(dāng)延長。再分離急性肉芽腫細(xì)胞得所獲結(jié)果基礎(chǔ)上,分別采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶消化,第一次消化時(shí)間40 min,第二次消化時(shí)間30 min的條件下,粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞流式圖見圖6A。使用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶溶液,最終分離所獲的CD4+T細(xì)胞難以分群,見圖6B;且不獲得更多的淋巴細(xì)胞,見圖6C。因此,濃度為0.3 mg/mL的Ⅳ型膠原酶分離感染后12周肝臟肉芽腫細(xì)胞效果較好。由于已獲得較為滿意的分離效果,對于消化時(shí)間未做其它調(diào)整。

    圖6 不同膠原酶濃度消化分離感染12周肝臟肉芽腫細(xì)胞的效果Fig.6 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 12-week infection livers

    3 討 論

    宿主感染血吸蟲后,機(jī)體會逐漸產(chǎn)生一系列的免疫防御反應(yīng),CD4+T細(xì)胞具有重要作用,CD4+T細(xì)胞分化的Th1、Th2、Treg和Th17等細(xì)胞在血吸蟲感染后的不同階段參與免疫應(yīng)答,分泌的細(xì)胞因子相互調(diào)控參與機(jī)體免疫應(yīng)答[8]。在血吸蟲感染動物模型中,早期主要形成Th1型免疫應(yīng)答[9],晚期會轉(zhuǎn)化,以Th2型細(xì)胞因子為主的免疫應(yīng)答環(huán)境[10-11];而Treg細(xì)胞已被證明可使血吸蟲感染由急性轉(zhuǎn)為慢性感染[12-13];Th17細(xì)胞參與了蟲卵導(dǎo)致的急性肉芽腫和肝纖維化,而且IL-17和IFN-γ在血吸蟲感染過程中相互調(diào)節(jié)[14-16]。因此,獲得足量、純凈的肝臟肉芽腫活細(xì)胞,特別是細(xì)胞表面標(biāo)志保存完整的CD4+T細(xì)胞對于血吸蟲性肝臟疾病的細(xì)胞學(xué)的研究至關(guān)重要。

    Pellegrino等采用勻漿機(jī)破碎肝臟,然后生理鹽水反復(fù)洗滌、自然沉淀的方法獲得肉芽腫組織,缺點(diǎn)是肉芽腫上仍附著有肝組織[17];Ragheb等采用上述方法獲得肉芽腫組織后,采用Ⅳ型膠原酶和DNase I在37 ℃水浴搖床消化肉芽腫顆粒30~50 min分離曼氏血吸蟲感染8周和20周的CBA/J小鼠[4]。Metwali等采用0.5%的Ⅳ型膠原酶37 ℃水浴搖床消化30~40 min分離曼氏血吸蟲感染8周CBA/J小鼠的肝臟肉芽腫細(xì)胞[18-19]。以上這些分離肉芽腫細(xì)胞的方法存在不同的缺陷:如肉芽腫細(xì)胞不純(含有肝漿);或是細(xì)胞表面標(biāo)志丟失;或是細(xì)胞的活性降低影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    研究表明日本血吸蟲與曼氏血吸蟲治病力不同,如曼氏血吸蟲感染C57BL/6小鼠僅產(chǎn)生較小的肝臟肉芽腫,而感染CBA/J小鼠則發(fā)生強(qiáng)烈的肉芽腫反應(yīng),程度與日本血吸蟲感染的C57BL/6小鼠相似,因而上述關(guān)于曼氏血吸蟲肉芽腫細(xì)胞分離方法不適用于分離日本血吸蟲肉芽腫細(xì)胞。本研究在Yole[20]建立的Ⅳ型膠原酶兩步消化法分離肉芽腫細(xì)胞的基礎(chǔ)上,對膠原酶濃度和消化時(shí)間進(jìn)行探索,建立了針對日本血吸蟲感染C57BL/6小鼠急、慢性肝臟肉芽腫細(xì)胞分離的有效方法。通過第一步膠原酶消化,去除了肉芽腫周圍的肝組織,過濾后得到了干凈的肉芽腫顆粒;通過第二步膠原酶消化和注射器機(jī)械吹打,有效地分散了組成肉芽腫的各種細(xì)胞。

    感染6周的小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞流式檢測的結(jié)果顯示,稍高的膠原酶濃度或者過久的消化,都會導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞分群不明顯,而過低的膠原酶濃度也無法分離出足夠CD4+T細(xì)胞,所以對于感染了6周小鼠的肝臟,建議采用0.25 mg/mL的膠原酶消化液,兩步消化時(shí)間為30 min/30 min,此時(shí)CD4+T細(xì)胞比例高且細(xì)胞分群明顯。隨著感染時(shí)間的推移,肝臟肉芽腫炎癥由急性感染轉(zhuǎn)化為慢性感染并伴隨有肝纖維化,肝臟的膠原含量會逐漸增多(天狼星紅染色結(jié)果可見),因此,需要改變膠原酶濃度和消化時(shí)間。結(jié)果表明:分離感染12周的小鼠肝臟肉芽腫細(xì)胞最佳膠原酶濃度為0.3 mg/mL的酶濃度,分離的CD4+T細(xì)胞比例較高,且分群明顯;而使用0.5 mg/mL的膠原酶濃度則會破壞CD4+T細(xì)胞表面蛋白,且細(xì)胞分群不明顯。

    本研究提供的分離肉芽腫細(xì)胞的方法可重復(fù)性好,步驟簡單易操作;整個過程不超過2 h;不需要淋巴細(xì)胞分離液等試劑輔助純化;可以包括粒細(xì)胞在內(nèi)的組成肉芽腫的主要細(xì)胞群;而且細(xì)胞純度高、活性好(臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活性達(dá)95%),獲得肉芽腫細(xì)胞,完全可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)(如刺激培養(yǎng)、流式分選等)的要求??蓮V泛地用于日本血吸蟲肝臟肉芽腫疾病的細(xì)胞免疫研究,特別是為進(jìn)一步研究肉芽腫細(xì)胞中的Th1、Th2、Th17和Treg等輔助性T細(xì)胞的提供了一種可靠的CD4+T細(xì)胞分離技術(shù)。

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