Survivin- siRNA敏感腫瘤株的篩選及其侵襲和遷移的作用機(jī)制研究

周偉華

(宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

惡性腫瘤是當(dāng)今威脅人類生命健康的主要?dú)⑹种?，并且惡性腫瘤的治療是長(zhǎng)期困擾醫(yī)學(xué)界的世界性難題。Survivin基因是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用，在腫瘤細(xì)胞及胚胎組織中呈高表達(dá)，而在成人絕大多數(shù)正常組織中被關(guān)閉而很少表達(dá)[1- 3]。RNA干擾技術(shù)是近幾年興起的生物技術(shù)，用小分子干擾RNA(siRNA)干擾特定基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分。本研究運(yùn)用RNA干擾技術(shù)和抗腫瘤藥物篩選平臺(tái)，設(shè)計(jì)篩選高效的靶向Survivin基因的抗腫瘤siRNA前體藥物，并探討其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞株 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299、肝癌細(xì)胞株SMMC- 7721、甲狀腺癌細(xì)胞株8505C、乳腺癌細(xì)胞株MCF- 7、結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HCT- 116、食管癌細(xì)胞株EC109，均由中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。

1.1.2 主要藥品與試劑 Survivin siRNA脂質(zhì)體(1 mg·L-1)，由本課題組制備。RPMI- 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、Trizol試劑(美國(guó)Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，Survivin抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(matrix metalloproteinases- 9，MMP- 9)抗體和粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)抗體(英國(guó)Abcam公司)，胎牛血清、β- actin抗體、HRP- 羊抗鼠IgG、ECL Prime蛋白印跡試劑(上海碧云天生物公司)。Survivin、MMP- 9、FAK和GAPDH引物序列均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

名 稱序列產(chǎn)物長(zhǎng)度/pbSurvivin正向引物:5'-GACAGATGAAGGTTGGG-3'反向引物:5'-AGGTGGATGAGGAGACAGA-3'228MMP-9正向引物:5'-AAATGTGGGTGTACACAGGC-3'反向引物:5'-TTCACCCGGTTGTGGAAACT-3'310FAK正向引物:5'-TTGCGGAGAATATGGCTGAC-CTAA-3'反向引物:5'-TGGTATTGATGGCAAAGCCCGT-TC-3'116GAPDH正向引物:5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3'反向引物:5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'110

1.1.3 主要儀器 低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Molecular Devices公司)，定量PCR儀、Western blotting電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)BIORAD公司)，F(xiàn)luor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司)。

1.2 方法

1.2.1 Survivin siRNA脂質(zhì)體的制備 根據(jù)Invitrogen公司的網(wǎng)上設(shè)計(jì)系統(tǒng)(http:www.invitrogen.com)進(jìn)行Survivin基因的siRNA片段設(shè)計(jì)。Survivin- siRNA序列的正義鏈為5′- GAAGCAGUUUGAAGAAUUATT- 3′，反義鏈為5′- UAAUUCUUCAAACUGCUUCTr- 3′。Survivin- siRNA序列均由杭州四季青生物工程公司制備。在攪拌條件下將siRNA加入陽離子脂質(zhì)、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇(4∶1∶4∶1)混合物，超聲10 min，形成Survivin- siRNA脂質(zhì)體(1 mg·ml-1)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細(xì)胞株，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，用含10%(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿90%時(shí)進(jìn)行消化、傳代，取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法篩選Survivin- siRNA的敏感腫瘤菌株 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細(xì)胞，常規(guī)消化，離心，重懸細(xì)胞并調(diào)整至1×105個(gè)·ml-1，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁后，在各培養(yǎng)孔分別加入不同濃度的Survivin- siRNA脂質(zhì)體，終濃度分別0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0和100.0 μg·ml-1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為等體積空白脂質(zhì)體。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入5 mg·ml-1MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加DMSO 150 μl·孔-1，振蕩溶解15 min，立即用分光光度計(jì)測(cè)定在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。選擇對(duì)Survivin- siRNA最敏感的腫瘤株8505C進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)板加入甲狀腺癌細(xì)胞株8505C 1×105個(gè)·孔-1，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層。用100 μl移液槍頭沿培養(yǎng)板底部垂直劃線，用PBS沖洗，分別加入不同濃度的Survivin- siRNA脂質(zhì)體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為等體積空白脂質(zhì)體，培養(yǎng)24 h后拍照，測(cè)量間距。各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 制備Transwell小室(上室)，加入100 μl密度為105個(gè)·ml-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的8505C細(xì)胞，將上室放入細(xì)胞培養(yǎng)板孔(下室)。下室加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質(zhì)體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為等體積空白脂質(zhì)體。培養(yǎng)24 h后取出上室，用棉簽將上室內(nèi)細(xì)胞刮除，用多聚甲醛固定，染色，雙蒸水沖洗上室，在相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 RT- PCR實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)板加入甲狀腺癌細(xì)胞株8505C 1×105個(gè)·孔-1，各孔分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質(zhì)體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為等體積空白脂質(zhì)體。將96孔板置于5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。Trizol提取細(xì)胞總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定260和280 nm的吸光度值，以RNA電泳檢測(cè)其完整性。取總RNA進(jìn)行cDNA合成。采用RT- PRC儀測(cè)定Survivin、MMP- 9和FAK mRNA的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達(dá)量以內(nèi)參物GAPDH的相對(duì)定量表示。

1.2.7 Westen blotting實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)板加入甲狀腺癌細(xì)胞株8505C 1×105個(gè)·孔-1，各培養(yǎng)孔分別加入不同濃度Survivin- siRNA脂質(zhì)體，終濃度分別為1.0、3.0和10.0 μg·ml-1，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為等體積空白脂質(zhì)體。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰浴，離心，取上清液測(cè)定蛋白濃度。制備SDS- PAGE凝膠，加樣后電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Survivin、MMP- 9和FAK抗體，4 ℃過夜，TBST緩沖液洗膜，加入HRP- 羊抗鼠IgG，25 ℃孵育1 h，洗膜，顯色，顯影。Survivin、MMP- 9和FAK的表達(dá)量以各自吸光度值與β- actin吸光度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin- siRNA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

Survivin- siRNA對(duì)H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細(xì)胞株均有一定程度的抑制作用，見圖1。其中，Survivin- siRNA對(duì)8505C細(xì)胞株抑制作用最強(qiáng)(IC50=5.83 μg·ml-1)，選擇8505C細(xì)胞株為Survivin- siRNA敏感菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1Survivin-siRNA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用(n=6)

2.2 Survivin- siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞遷移的影響

在腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，1 μg·ml-1組和陰性對(duì)照組劃痕刻度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組劃痕刻度較陰性對(duì)照組顯著增大(P<0.01)，并且10 μg·ml-1組劃痕刻度較3 μg·ml-1組顯著增大(P<0.05)，見圖2。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖2Survivin-siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞遷移的影響(n=6)

2.3 Survivin- siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞侵襲的影響

在腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，1 μg·ml-1組和陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組穿膜細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組顯著減少(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組穿膜細(xì)胞數(shù)量較3 μg·ml-1組顯著減少(P<0.05)，見圖3。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖3Survivin-siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞侵襲的影響(n=6)

2.4 Survivin- siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達(dá)的影響

在RT- PCR實(shí)驗(yàn)中，1 μg·ml-1組和陰性對(duì)照組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK mRNA表達(dá)較3 μg·ml-1組顯著降低(P<0.05)，見圖4。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖4Survivin-siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞Survivin、MMP-9和FAKmRNA表達(dá)的影響(n=6)

2.5 Survivin- siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達(dá)的影響

在Western blotting實(shí)驗(yàn)中，1 μg·ml-1組和陰性對(duì)照組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；并且10 μg·ml-1組Survivin、MMP- 9和FAK蛋白表達(dá)較3 μg·ml-1組顯著降低(P<0.05)，見圖5。

與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與1.0 μg·ml-1組比較，bP<0.05；與3.0 μg·ml-1組比較，cP<0.01

圖5Survivin-siRNA對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞Survivin、MMP-9和FAK蛋白表達(dá)的影響(n=6)

3 討 論

siRNA是近10年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最突出的發(fā)現(xiàn)之一，siRNA技術(shù)不但是研究功能基因強(qiáng)有力工具，而且也是基因治療行之有效的武器。應(yīng)用siRNA技術(shù)干擾特定致病基因的表達(dá)是基因治療的重要組成部分，這為某些惡性疑難疾病的治療帶來了新希望。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)Survivin是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的基因之一，該基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平異常升高，而在成人絕大多數(shù)正常組織中被關(guān)閉。該基因在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)后不僅促進(jìn)細(xì)胞抗凋亡[4]、加速細(xì)胞有絲分裂[5]，還增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐受性[6]，促進(jìn)腫瘤組織血管的形成。靶向該基因的抗腫瘤基因治療藥物的毒副作用可能較小，安全性較好。本研究在H1299、SMMC- 7721、8505C、MCF- 7、HCT- 116和EC109細(xì)胞株中篩選對(duì)Survivin- siRNA敏感的菌株，結(jié)果顯示Survivin- siRNA對(duì)上述6種腫瘤細(xì)胞株均有一定程度的抑制作用，但是Survivin- siRNA對(duì)8505C細(xì)胞株抑制作用最強(qiáng)。因此將Survivin- siRNA的目標(biāo)腫瘤鎖定為甲狀腺癌，選擇8505C細(xì)胞株為Survivin- siRNA敏感菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

侵襲和遷移是甲狀腺癌治療失敗的最常見原因，也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的原因。侵襲是腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)向局部臨近組織的浸潤(rùn)，而轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞突破血管膜或淋巴管膜并在其他器官生長(zhǎng)。在癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，3 μg·ml-1和10 μg·ml-1Survivin- siRNA劃痕刻度較陰性對(duì)照組顯著增大(P<0.01)，并且10 μg·ml-1組劃痕刻度較3 μg·ml-1組顯著增大(P<0.05)，說明Survivin- siRNA可劑量依賴性抑制甲狀腺癌8505C細(xì)胞的遷移；在癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，3 μg·ml-1組和10 μg·ml-1組穿膜細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組顯著減少(P<0.05)，并且10 μg·ml-1組穿膜細(xì)胞數(shù)量較3 μg·ml-1組顯著減少(P<0.05)，說明Survivin- siRNA可劑量依賴性抑制甲狀腺癌8505C細(xì)胞的侵襲。

細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)間的信號(hào)通路失衡是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因之一[7]。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，其作為多條信號(hào)通路的上游分子廣泛參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。FAK活化后可通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，因此FAK的高表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)[8- 9]。MMPs是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的鋅離子依賴內(nèi)肽酶，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10]。目前已確定的MMPs有26種，其中MMP- 9可降解ECM中的Ⅳ型以及Ⅴ型膠原纖維[11]，參與腫瘤組織轉(zhuǎn)移[12- 13]。本研究結(jié)果顯示，3 μg·ml-1和10 μg·ml-1Survivin- siRNA可顯著降低甲狀腺癌8505C細(xì)胞中Survivin、MMP- 9和FAK mRNA和蛋白的表達(dá)，說明Survivin- siRNA抗甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用可能與其抑制Survivin、MMP- 9和FAK表達(dá)有關(guān)。

總之，Survivin- siRNA作為新型的抗腫瘤藥物對(duì)甲狀腺癌8505C細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，并且可以抑制8505C細(xì)胞的遷移和侵襲，這可能與其抑制細(xì)胞Survivin、MMP- 9和FAK的表達(dá)有關(guān)。