食鹽對小鼠腸道微生物、酶活及血常規(guī)的影響

朱佳源 鄭 淘 肖嫩群 羅懷浩 龔 郡 包思慧

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘杏學(xué)院，湖南 長沙 410208；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

鈉的來源廣泛，食鹽是鈉攝入的主要來源。但食鹽攝入過高或過低，都不利于身體健康。研究表明，食鹽的攝入量與高血壓發(fā)生率呈正比，低食鹽攝入可以有效防治高血壓，明顯降低其引發(fā)的相關(guān)疾病[1]；長期過量攝入食鹽可能導(dǎo)致糖尿病、中風(fēng)及冠心病等的發(fā)生[2]，還可能誘發(fā)哮喘、胃癌、前列腺增生以及骨質(zhì)疏松[3-4]；而食鹽用量過低，可能發(fā)生低鈉綜合征，情況嚴(yán)重的還會心臟衰竭而死亡[5]。

動物腸道中含有大量微生物。研究[6]表明，腸道菌群可以稱作人體的“第二基因組”“第二大腦”或“微生物器官”，其群落結(jié)構(gòu)在人體的許多生理功能上發(fā)揮重要作用，如機體能量吸收、物質(zhì)代謝、胃腸道功能的完善及免疫功能的調(diào)節(jié)等。人體的許多疾病均與腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)失衡有關(guān)，如肥胖、糖尿病、心腦血管疾病、胃腸道癌癥、炎癥性腸炎(IBD)、腸易激綜合征(IBS)、自身免疫性疾病以及自閉癥、抑郁癥、老年癡呆等精神性疾病等。腸道微生物與宿主的共生關(guān)系與人體的健康有著千絲萬縷的關(guān)系。哺乳動物體內(nèi)的酶可參與宿主糖類、氨基酸、脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，在機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收、生理機能完善、提供能源物質(zhì)等方面具有重要意義[7-8]。至今，沒有食鹽對腸道微生物影響的相關(guān)報道，研究食鹽對腸道微生物的影響，有助于揭示食鹽對機體健康影響及其機制。

血常規(guī)檢查是臨床上最基礎(chǔ)的化驗檢查之一，主要包括紅細(xì)胞系統(tǒng)、白細(xì)胞系統(tǒng)和血小板系統(tǒng)，它對全身性疾病的早期跡象、貧血、血液系統(tǒng)疾病等診斷具有重要意義。紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容下降提示貧血的存在，增加則可能存在紅細(xì)胞增多癥。白細(xì)胞增高疑有炎癥，多為細(xì)菌感染。血小板降低有出血傾向，增高則容易形成血栓[9]。這類指標(biāo)對于人們膳食的營養(yǎng)學(xué)評價具有重要作用。

本試驗擬對食鹽攝入量影響腸道微生物、酶活性及血常規(guī)的特征進行研究，以期為人們合理膳食用鹽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30只昆明小鼠(Kunming mice，KM小鼠)：SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g，湖南斯萊克斯動物實驗有限公司；

飼料：玉米30%、麩皮26%、豆餅29%、食鹽1%、骨粉1%、賴氨酸1%、水12%，根據(jù)以上配比粉碎后制粒，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心；

細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；

大腸桿菌：伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)；

乳酸菌：乳酸細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)基(MRS)；

雙歧桿菌：雙歧桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基(BBL)。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組 小鼠在適宜的環(huán)境下(相對濕度50%～70%，室溫23～25 ℃，清潔安靜)適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組6只，雌雄各半。

1.2.2 食鹽給量 根據(jù)《中國居民膳食指南》人均每日食鹽攝入推薦量6 g[10]，A～E組分別設(shè)置0，3，6，9，12 g梯度鹽量，依次換算成小鼠食鹽量0.00，0.16，0.32，0.48，0.64 mg/(g·d)。將食鹽配成相應(yīng)濃度后進行灌胃，2次/d，每次0.4 mL，期間間隔8 h。

1.2.3 血樣的采取及檢測 眼球采血。根據(jù)要求，取樣前禁食12 h，禁水1 h，每只1.5～2.0 mL，在EDTA-K2抗凝管中輕輕混勻，2 h內(nèi)送湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科進行血常規(guī)檢測。

1.2.4 腸道內(nèi)容物的采集 小鼠處死后放于超凈工作臺上，無菌操作采集小鼠空腸到回腸段的腸道內(nèi)容物，同組混勻備用。

1.2.5 腸道微生物數(shù)量的分析 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，無菌操作稱取腸道內(nèi)容物至裝有玻璃珠及無菌水的三角瓶中，120 r/min 振搖30 min后，十倍稀釋法進行稀釋，涂抹法接種培養(yǎng)。細(xì)菌和大腸桿菌在37 ℃培養(yǎng)24 h進行計數(shù)，乳酸菌和雙歧桿菌在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h進行計數(shù)，3次重復(fù)，換算成每克腸道內(nèi)容物的菌數(shù)。

1.2.6 腸道酶活性的測定 用無菌水稀釋腸道內(nèi)容物后，在40 ℃水浴保溫30 min，充分溶出酶蛋白，2 000 r/min離心10 min，上清液用于酶活性的分析。采用DNS比色法測定木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶的活性，福林-酚法測定蛋白酶的活性[12]。用1 g腸道內(nèi)容物50 ℃、30 min生成1 μg還原糖分別定義為一個纖維素酶活單位(U)和木聚糖酶活單位(U)；1 g腸道內(nèi)容物在40 ℃、30 min生成1 μg還原糖定義為一個淀粉酶活單位(U)；1 g腸道內(nèi)容物在37 ℃、30 min生成1 μg氨基酸定義為一個蛋白酶活單位(U)。

1.2.7 數(shù)據(jù)的處理方法 用SPSS 21.00軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析判斷各組均數(shù)間的差異，兩組間均數(shù)差異比較用獨立樣本t檢驗，各組的數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 食鹽量對小鼠腸道微生物的影響

由表1可知，食鹽量最高的E組乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、雙歧桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均為最高，與對照組比較具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。C組與A組比較，乳酸菌數(shù)和雙岐桿菌數(shù)沒有差異性，細(xì)菌總數(shù)卻下降明顯(P<0.01)，而大腸桿菌數(shù)顯著增加(P<0.01)。B組的乳酸菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)與A組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而雙岐桿菌和大腸桿菌數(shù)增加顯著(P<0.01)。日服用3 g食鹽的小鼠腸道雙歧桿菌數(shù)顯著增加，乳酸菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)與空白組沒有差異；而日服用12 g 食鹽的小鼠腸道乳酸菌數(shù)、細(xì)菌總數(shù)、雙岐桿菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組。說明日服用適當(dāng)?shù)氖雏}能夠促進雙歧桿菌等益生菌的生長來促進和維護機體健康，而長期高鹽攝入可能使腸道菌群失調(diào)，可能引起心腦血管相關(guān)疾病。總體來看，食鹽對大腸桿菌的影響最明顯，均能促進腸道大腸桿菌的生長，可能是為其生長繁殖提供了某種促進因子。

2.2 食鹽量對小鼠腸道酶活性的影響

由表2可知，食鹽攝入對小鼠腸道蛋白酶活性具有抑制作用，其中B組活性降低最小，與A組最接近。淀粉酶方面，B、C組與A組比較酶活性下降，B組降低較少，與A組接近，而D、E組酶活性高于A組，其中食鹽量最高的E組淀粉酶活性最高。另外B組小鼠的腸道木聚糖酶活性、纖維素酶活性也顯著提高(P<0.01或P<0.05)。試驗可知，食鹽量越高，小鼠淀粉酶活性越高，日服用12 g食鹽，淀粉酶活性最高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組，說明高鹽膳食是糖尿病發(fā)生的一個潛在因素。日服用3 g食鹽，淀粉酶活性有所降低，但與空白組活性最接近，且木聚糖酶、纖維素酶活性顯著增加，這有利于小鼠營養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善腸道健康，提高動物的非特異性免疫能力，從而提高小鼠的健康水平[13]。合理膳食用鹽，有利于腸道酶活性的調(diào)節(jié)，減少糖尿病發(fā)生的幾率，維護機體代謝和人體健康。

2.3 食鹽量對小鼠血小板的影響

血小板在機體參與止血與血栓形成中起重要作用。由表3可知，B、C、D、E組分別與A組比較，在血小板平均體積(Mean platelet volume,MPV)、血小板體積分布寬度(Platelet volume distribution width,PDW)方面有顯著差異(P<0.01或P<0.05)，但B、C、D、E各組間比較沒有差異性(P>0.05)。B組小鼠的血小板計數(shù)為各組中最高，對提高小鼠凝血功能具有重要意義。日服用3 g食鹽，小鼠的血小板數(shù)量最高，可能與小鼠食鹽后脾亢有關(guān)。

2.4 食鹽量對小鼠紅細(xì)胞的影響

由表4可知，B、C、D、E組分別與A組比較，在紅細(xì)胞計數(shù)、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均體積和紅細(xì)胞分布寬度方面沒有任何統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明膳食用鹽不會影響機體貧血。

2.5 食鹽量對小鼠血紅蛋白的影響

由表5可知，B組與A組小鼠的血紅蛋白及紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量接近，但B組小鼠的紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度最高。C組的紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度分別與B組和D組比較下降明顯(P<0.05)。

2.6 食鹽量對小鼠白細(xì)胞的影響

由圖1可知，B組小鼠的白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)含量最高。C組與A、B組比較白細(xì)胞數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.01或P<0.05)。日服用6，9，12 g食鹽，小鼠的白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)均低于空白組和日服用3 g食鹽組。有研究[13]表明，高鹽飲食者易患感冒，是因為高濃度食鹽能抑制呼吸道細(xì)胞活性，使機體抗病能力下降；同時還減少唾液及口腔溶菌酶，增加病毒和病菌感染呼吸道的機會，可能與高鹽飲食降低血液中白細(xì)胞數(shù)和淋巴數(shù)量有關(guān)。

表1 食鹽量對小鼠腸道微生物的影響?Table 1 Effect of salt doses on mice intestinal microbes (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表2 食鹽量對小鼠腸道酶活性的影響?Table 2 Effect of salt doses on mice intestinal enzyme activities (n=6) U/g

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表3 食鹽量對小鼠血小板的影響?Table 3 Effect of salt doses on mice platelet (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表4 食鹽量對小鼠紅細(xì)胞的影響?Table 4 Effect of salt doses on mice red blood cell (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表5 食鹽量對小鼠血紅蛋白的影響?Table 5 Effect of salt doses on mice hemoglobin (n=6)

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

*. P<0.05 **. P<0.01 圖1 食鹽量對小鼠白細(xì)胞的影響Figure 1 Effect of salt doses on mice white blood cell (n=6)

3 結(jié)論

膳食用鹽可能通過影響腸道菌群平衡，引起機體血壓等心腦血管疾病的發(fā)生；食鹽改變腸道酶活性，引起機體代謝變化，可能是糖尿病發(fā)生的一個因素；高鹽攝入不利于身體健康，可能降低機體免疫功能，增加機體患病的風(fēng)險。綜合分析腸道微生物、腸道酶活以及血常規(guī)各項數(shù)據(jù)，建議成人每天按3 g食鹽標(biāo)準(zhǔn)食用較好。

微生物培養(yǎng)法不能全面知曉腸道中的微生物特征，只能對在所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長的微生物進行認(rèn)知，隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進一步運用新的生物學(xué)研究技術(shù)，探討食鹽影響機體健康的關(guān)鍵菌群，將更加有利于指導(dǎo)合理膳食用鹽。運用代謝組學(xué)等方法探討膳食用鹽對腸道菌群的影響，將更加有利于研究食鹽對機體代謝性疾病影響的機制。