林高城 陳云歡 楊莉惠 陳雨 鄒愉龍 余友金
動脈粥樣硬化(As) 是一種由血脂代謝紊亂和血管慢性炎癥共同作用而形成的疾病,單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在AS形成中扮演著重要的角色[1]。在高脂血癥狀態(tài)下,為了清除局部組織和血液系統(tǒng)中過多的脂質(zhì),全身單核/巨噬細(xì)胞被激活,大量增生并攝取氧化型低密度脂蛋白從而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞,分泌大量的炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IL-6,加重局部炎癥反應(yīng)。澤瀉湯具有降脂、利水、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[2]。本文在張仲景《金匱要略》記載的澤瀉、白術(shù)5:2配伍比例的基礎(chǔ)上設(shè)計了 1:1、2:5組,來對比研究澤瀉湯的降血脂以及抑制炎癥因子表達的作用,探討配伍比例對澤瀉湯降血脂及抗炎癥因子作用的影響。
TNF-α、IL-6購自于武漢博士德生物科技有限公司,脂多糖為Sigma公司,臺盼藍染色液購于solarbio公司,PBS緩沖液、1640培養(yǎng)基購自Hyclone有限公司,SD大鼠(雄性)40只,購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(許可證號:SCXK(閩)2012-0001),Leica DM IL LED 倒置顯微鏡,細(xì)胞培養(yǎng)箱( Therom 公司,美國) 等。
SD大鼠40只,體質(zhì)量160~260 g,購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為正常對照組、高脂血癥組、A組、B組,C組,每組8只,飼養(yǎng)于SPF動物實驗室,室溫25℃、濕度 45%~65% ,喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。實驗時間為2015~2017年。
澤瀉、白術(shù)均購自于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,參考中藥藥理實驗方法學(xué)(上??茖W(xué)技術(shù)出版社,李儀奎著)制備相當(dāng)于生藥材2.64 g/ml的藥液:第一煎加水量約為總藥量的6倍,浸泡1 h,煎煮大概 20 min;第二煎加水量約為總藥量的4倍,煎0.5 h,兩次藥液混合后,再濃煎壓縮,4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>
正常對照組SD大鼠用普通大鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng),高脂血癥組、A組、B組、C組均用大鼠高脂飼料(即豬油10%,丙基硫氧嘧啶0.2%,膽固醇1%,脫氧膽酸鈉0.5%,蛋黃粉5%,蔗糖5%,基礎(chǔ)飼料78.3%,配方參照王瓊等[3]的研究)喂養(yǎng),A、B、C組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時給予相對應(yīng)的澤瀉湯灌胃,按1 ml/100 g灌胃給藥,A組:澤瀉:白術(shù)=5:2, B組:澤瀉:白術(shù)=1:1,C組,澤瀉:白術(shù)=2:5;每天2次,連續(xù)20 d,正常對照組及高脂血癥組給予等量生理鹽水灌胃。
5組大鼠在干預(yù)第20日后,均禁食不禁水12 h,經(jīng)大鼠眼眶取血,根據(jù)各指標(biāo)試劑盒說明書,檢測血漿中TC、TG、LDL-C含量。
借鑒蘭青等[4]辦法提取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,詳細(xì)方法如下:頸椎脫臼處死大鼠,手抓大鼠尾部將其浸入70%乙醇中,浸泡5~8 min后,從大鼠腹腔一側(cè)近45°角刺入腹腔,注射 1 640培養(yǎng)液 35~50 ml,在工作臺上打開大鼠腹腔,吸取其腹腔液約10 ml,1 200 r/min 離心8 min。去掉上清液后,留下離心管底部乳白色沉淀物,臺盼藍染色顯示細(xì)胞存活率>95%。
各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,吸去上清液,加入脂多糖( 10 mg /L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,之后進行TNF-α及IL-6的檢測。EILSA法檢測IL-6和 TNF-α濃度。操作步驟按說明書進行。均在450 nm波長讀取OD值,繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線自動計算IL-6和TNF-α濃度。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件進行處理,實驗數(shù)據(jù)以()表示,組間差異比較用F檢驗及獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與正常對照組比較,高脂血癥組大鼠血清TC、TG、LDL-C明顯上升(P<0.05),說明建立模型成功;A組、B組、C組的TC、LDL-C 的水平均顯著低于高脂血癥組(P<0.05),但高脂血癥組與澤瀉湯不同比例配伍組的TG比較變化不顯著(P>0.05),說明不同配伍比例的澤瀉湯組都具有明顯的降低TC、LDL-C作用。A組、B組的TC、LDL-C的水平均明顯小于C組(P<0.05),且A組降脂幅度更優(yōu)于B組(P<0.05),說明澤瀉:白術(shù)=5:2在降血脂方面有明顯優(yōu)勢。見表1。
與正常對照組比較,高脂血癥組TNF-α、IL-6 表達均增加顯著(P<0. 05);與高脂血癥組比較,A組、B組、C組TNF-α、IL-6 表達均明顯下降(P<0. 05);A組、B組TNF-α、IL-6 表達均明顯小于C組(P<0. 05);且以A組下降更為顯著(P<0.05)。見表2。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明澤瀉含有重要降血脂作用的成分為三萜類化合物,這種化合物主要有澤瀉醇 A、澤瀉醇 B、24-乙酰澤瀉醇A等。研究發(fā)現(xiàn)澤瀉醇 B 能影響血管平滑肌細(xì)胞,發(fā)揮澤瀉治療動脈粥樣硬化的作用[5],24-乙酰澤瀉醇A 不僅能抑制巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)而且還能抑制平滑肌細(xì)胞遷移、表型轉(zhuǎn)化,改善泡沫細(xì)胞脂質(zhì)累積等作用[6-7]。炒白術(shù)有比較顯著抗脂質(zhì)沉積及抗氧化作用,能增強人的免疫功能。從本實驗結(jié)果觀察,不同配伍比例的澤瀉湯均能顯著降低高脂血癥大鼠血清中的 TC、LDL-C 水平,其中澤瀉、白術(shù)按經(jīng)典比例配伍即 5:2 降血脂效果最明顯,配伍比例1:1 的降血脂作用次之,由此可見,配伍比例對澤瀉湯降血脂作用有一定影響。
表1 各組大鼠血脂水平比較(mmol/L,±s)
表1 各組大鼠血脂水平比較(mmol/L,±s)
注:與正常對照組比較,;與高脂血癥組比較;與澤瀉湯 A 組比較
表2 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6 表達比較(ng/L,)
表2 各組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6 表達比較(ng/L,)
注:與正常對照組比較,;與高脂血癥組比較;與澤瀉湯 A組比較
已有研究表明高脂血癥可促進巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞[8],經(jīng)過LPS刺激后巨噬細(xì)胞可分泌大量的炎癥因子[9]如TNF-α、IL-1β、IL-6加重局部病灶的炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子α通過促進血栓形成,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死、新生微小血管形成從而促進AS發(fā)生,在AS形成病理學(xué)方面,不管是在動脈發(fā)生內(nèi)膜增生還是內(nèi)皮功能紊亂的過程中,TNF-α都扮演著重要作用[10-12]。TNF-α和IL-6通過抑制ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出[13],白介素6可上調(diào)巨噬細(xì)胞低密度脂蛋白受體表達,促進巨噬細(xì)胞吞噬更多的低密度脂蛋白,加速脂質(zhì)沉積在血管壁上從而形成動脈斑塊,白介素6還可通過刺激巨噬細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1),MCP-1可促使單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集于血管內(nèi)皮引起炎癥反應(yīng)[14]。
本實驗通過較長時間的高脂飲食喂養(yǎng),成功建立高脂血癥模型,研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥組巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6的表達較正常對照組顯著增加,提示高脂血癥大鼠處于慢性炎性反應(yīng)狀態(tài),TNF-α和IL-6協(xié)同參與了動脈粥樣的形成,經(jīng)澤瀉湯治療后的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6明顯減少,尤其是經(jīng)典澤瀉湯配伍A組下降最明顯。澤瀉湯可通過影響炎癥因子與血脂代謝改善大鼠機體慢性炎癥狀態(tài),然而這一過程涉及的機制十分復(fù)雜,尚需更深入的研究與探索。