清熱化痰解毒方對(duì)卒中相關(guān)性肺炎大鼠 Akt/JNK3/Caspase-3和NF-κB信號(hào)通路的影響

王 濤，劉宏祥，王 穎，王 楊，劉 一，閆麗靜

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 保定 071000)

腦卒中屬于臨床常見腦血管疾病，其發(fā)病率、致死率逐年升高，而腦卒中患者中約50%死因?yàn)榉螕p傷[1]。目前關(guān)于腦卒中引發(fā)肺損傷機(jī)制研究較多，但尚未有統(tǒng)一定論。研究顯示炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，其中Akt屬于磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號(hào)通路中重要蛋白，其激活后能夠抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)腦損傷、肺損傷[2]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)在受到炎癥因子刺激后可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[3]。核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)被認(rèn)為是腦缺血后最先啟動(dòng)的炎癥因子，抑制其表達(dá)后能夠減輕腦缺血引發(fā)肺損傷[4]。Akt、JNK3、NF-κB是否也參與腦缺血引發(fā)的肺損傷，目前研究不多。清熱化痰解毒方要由郁金、蒲公英、丹參、杏仁、黃芩等組成，具有清熱解毒效果、活血透表祛風(fēng)、化痰止咳的功效，在肺部病變中應(yīng)用較多。臨床研究顯示直腸滴注清熱化痰方可治療腦病并發(fā)肺部感染，且效果較好[5]。清熱解毒中藥治療肺損傷患者后能夠明顯減輕肺組織病變，降低肺組織中炎癥指標(biāo)水平[6]。痰熱清干預(yù)肺損傷大鼠后可降低肺組織中MDA水平，升高SOD水平，改善肺組織病理保護(hù)肺部功能[7]。本研究通過制備腦缺血再灌注-肺損傷大鼠，并給予清熱化痰解毒方，以探究腦卒中相關(guān)性肺炎肺損傷的發(fā)病機(jī)制，為臨床研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠144只，體重為220～260 g，6月齡，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK(豫)2016-0002]，[SCXK(豫)2016-0009]。嚴(yán)格遵循動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境統(tǒng)一設(shè)定為溫度為25℃，濕度為60%，飲用蒸餾水，喂養(yǎng)期間保持房間干凈、通風(fēng)，并定時(shí)清理鼠籠。本研究經(jīng)河南省動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，審查編號(hào)：20160816。

1.2 主要試劑和儀器

藥品與試劑：清熱化痰解毒方(成分主要包括瓜蔞10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、蒲公英10 g、丹參10 g、桔梗10 g、杏仁10 g、射干10 g、川貝10 g、黃芩10 g，藥材均購(gòu)自于張仲景大藥房)；尼莫地平(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；批號(hào)：20160817；規(guī)格：20 mg)； p-Akt、p-JNK3、Caspase-3兔抗鼠單抗購(gòu)自于英國(guó)Abcam生物公司；p65、p50、β-actin兔抗鼠單抗購(gòu)自于美國(guó)SantaCruz公司；山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自于上海容創(chuàng)生物科技有限公司；蘇木素、伊紅染液購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒購(gòu)自于Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自于北京天根生化科技有限公司；儀器：全自動(dòng)生化檢測(cè)儀購(gòu)自于BECKMAN公司；SOD、MDA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于Biovision公司；SMZ745尼康光學(xué)顯微鏡購(gòu)于上海衡浩儀器有限公司；CFX96 PCR儀購(gòu)自于美國(guó)BioRad公司；GIS-500凝膠成像儀購(gòu)自于Miulab公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦缺血再灌注-肺損傷大鼠模型的建立

按參照文獻(xiàn)[8]制備腦缺血再灌注大鼠，腹腔注射3 mg/g 20%水合氯醛進(jìn)行麻醉，固定，消毒，分離頸總、內(nèi)外動(dòng)脈，用棉線于總動(dòng)脈處環(huán)向繞1 cm，兩側(cè)線環(huán)交叉埋于皮下并縫合切口。隨后轉(zhuǎn)移大鼠至立體定位儀暴露頸椎后將注射器插入頸椎橫突翼小孔內(nèi)，輕柔旋轉(zhuǎn)，當(dāng)有血液流出時(shí)，說明椎動(dòng)脈穿刺成功。24 h后打開頸部切口，采用顯微鏡動(dòng)脈夾將雙側(cè)勁動(dòng)脈夾住后阻斷腦部供血，15 min后撤去動(dòng)脈夾恢復(fù)腦部供血。造模后符合以下的大鼠確定為肺部感染：(1)精神萎靡、毛發(fā)光澤度差、進(jìn)食量減少、飲水增多、體重降低、耳緣靜脈突起加粗、鼻唇分泌液增多；(2)呼吸急促，肺部出現(xiàn)啰音。

1.3.2 動(dòng)物分組以及給藥方法

所有大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(僅暴露頸總動(dòng)脈，不阻斷血管)、模型組、清熱化痰解毒方低、中、高劑量預(yù)處理組、陽(yáng)性組(尼莫地平組)，每組24只。(1)假手術(shù)組、模型組大鼠均灌胃等量生理鹽水；(2)清熱化痰解毒方低、中、高劑量藥物劑量為7、14、28 mg/kg；(3)陽(yáng)性組給藥劑量為200 mg/kg尼莫地平。各組給藥時(shí)間為預(yù)處理大鼠在造模前3日灌胃，每日2次，最后一次給藥時(shí)間為造模前3 h，共給藥7次。給藥劑量參照人體表法[9]計(jì)算，成年人標(biāo)準(zhǔn)體重60 kg，大鼠給藥劑量為成人的6.25倍，成人每日給藥劑量為60 mg，所有大鼠平均體重220 g，則大鼠每日給藥劑量為7 mg/kg。

1.3.3 動(dòng)脈氧分壓的測(cè)定

于大鼠右側(cè)股動(dòng)脈采集2 mL血液，采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀對(duì)動(dòng)脈血氧分壓(Partial pressure of oxygen，PaO2)進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算氧合指數(shù)(oxygenation index， OI)。

1.3.4 大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophil leukocyte，PMN)計(jì)數(shù)

各組選取12只大鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，利用自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)BAL中PMN進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5 大鼠肺組織濕干重變化

各組隨機(jī)選取12只大鼠處死后，將右肺下葉用濾紙吸干水后置于玻璃試管中稱重，所測(cè)重量為濕重，隨后放置在干燥箱中，溫度設(shè)為80℃，連續(xù)烘烤直至質(zhì)量測(cè)定不變時(shí)此時(shí)重量為干重，計(jì)算大鼠肺組織W/D。

1.3.6 肺組織SOD、MDA以炎癥因子檢測(cè)

用無(wú)菌剪刀將肺組織剪碎，制作10%勻漿液，放置低溫離心機(jī)中4000 r/min離心10 min，收集上清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-1β活性，具體參照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3.7 Western blot檢測(cè)肺組織中Akt/JNK3/Caspase-3和NF-κB蛋白表達(dá)

肺組織剪碎后添加蛋白裂解液放置30 min，離心后收集上清液，參照蛋白提取試劑盒提取肺組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，置于凝膠成像儀中觀察Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達(dá)情況。

1.3.8 免疫組化法檢測(cè)肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白陽(yáng)性表達(dá)

常規(guī)制備肺組織石蠟切片，免疫組組化法檢測(cè)肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性百分比=陽(yáng)性數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般癥狀觀察

大鼠在模型制備過程中，未出現(xiàn)死亡，造模成功大鼠共96只。假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)較好，毛發(fā)光澤，飲水、攝食正常，體重逐漸增加，耳唇分泌液正常，呼吸正常。模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)光澤度差、進(jìn)食量減少、飲水增多、體重降低、耳緣靜脈突起加粗、鼻唇分泌液增多，呼吸急促，肺部出現(xiàn)啰音。經(jīng)清熱化痰解毒方治療后，得到不同程度改善。

2.2 各組大鼠動(dòng)脈氧分壓以及PMN測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組肺組織干濕重比值、中性粒細(xì)胞數(shù)升高，動(dòng)脈氧分壓、氧合指數(shù)均降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、清熱化痰解毒方組W/D、PMN降低，PaO2、OI、PMN升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 肺組織光鏡檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與假手術(shù)組相比，模型組肺組織毛細(xì)血管擴(kuò)張，彌漫性充血，出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞滲出以及炎性浸潤(rùn)，肺泡壁增厚、充血；陽(yáng)性組、燈盞花素治療組大鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見下圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織病理評(píng)分升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、清熱化痰解毒方組大鼠肺組織病理評(píng)分均降低，隨著給藥劑量的升高，肺組織病理評(píng)分逐漸降低，差異有顯著性(P< 0.05)。給藥后，假手術(shù)組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分分別為0、(3.78±0.74)、(2.87±0.52)、(2.28±0.71)、(0.97±0.28)和(0.64±0.17)分，各組組間比較差異有顯著性(P< 0.05)。

2.4 各組SOD、MDA水平測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組SOD降低，MDA、TNF-α、IL-1β升高，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、清熱化痰解毒方組SOD升高，MDA、TNF-α、IL-1β降低，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。見下表2。

表1 各組大鼠W/D、PaO2、OI水平對(duì)比

注：與假手術(shù)組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

圖1 肺組織病理形態(tài)學(xué)(HE染色，×400)

表2 各組大鼠SOD、MDA水平對(duì)比

Table 2 Comparison of SOD and MDA levels in rats in each group

組別 GroupsSOD(NU/mg)MDA(umol/g) TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) 假手術(shù)組 Sham group模型組 Model group低劑量組Low dose group中劑量組Middle dose group高劑量組High dose group陽(yáng)性組Positive group36.69±2.0722.63±1.29*25.76±1.03#28.56±1.19#a34.18±1.55#ab33.29±1.14#134.27±13.66203.75±16.38*184.69±16.44#167.33±15.85#a155.49±15.79#ab145.63±15.49#16.57±4.22257.56±20.64*200.18±23.44#170.23±19.25#a141.69±15.53#ab105.76±14.28#6.04±1.06193.54±28.46*134.25±20.34#113.49±15.48#a91.39±10.65#ab82.45±11.39#

注：與假手術(shù)組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group, *P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

2.5 Western blot檢測(cè)肺組織中Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達(dá)升高，p-Akt蛋白表達(dá)降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、清熱化痰解毒方組p-Akt、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達(dá)降低，p-Akt蛋白表達(dá)升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。各組Akt、JNK3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P> 0.05)。見表3,圖2。

2.6 免疫組化檢測(cè)肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組p-JNK3、p65、p50蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，p-Akt蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，差異有顯著性(P< 0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、清熱化痰解毒方組p-JNK3、p65、p50陽(yáng)性表達(dá)率降低，p-Akt蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高，具有劑量依賴性，差異有顯著性(P< 0.05)。見表4。

注：A：假手術(shù)組;B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：陽(yáng)性組。

表3 大鼠肺組織中Akt、p-Akt、JNK3、p-JNK3、Caspase-3、p65、p50蛋白表達(dá)

Table 3 Expression of Akt, p-Akt, JNK3, p-JNK3, Caspase-3, p65, and p50 proteins in rat lung tissue

組別 GroupsAktp-AktJNK3p-JNK3Caspase-3p65p50假手術(shù)組 Sham group0.72±0.130.76±0.040.58±0.120.17±0.030.22±0.041.29±0.061.16±0.05模型組 Model group0.69±0.16*0.13±0.08*0.64±0.11*0.95±0.09*0.83±0.08*0.22±0.03*0.18±0.05*低劑量組Low dose group0.62±0.14#0.24±0.09#0.66±0.11#0.78±0.09#0.68±0.13#0.49±0.03#0.33±0.08#中劑量組Middle dose group0.67±0.12#a0.42±0.06#a0.63±0.14#a0.64±0.13#a0.52±0.06#a0.71±0.11#a0.76±0.06#a高劑量組High dose group0.70±0.16#ab0.58±0.13#ab0.61±0.13#ab0.48±0.08#ab0.38±0.09#ab0.97±0.09#ab0.92±0.07#ab陽(yáng)性組Positive group0.60±0.18#0.63±0.05#0.56±0.12#0.21±0.03#0.26±0.05#1.11±0.08#1.05±0.06#

注：與正常組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

表4 肺組織中p-Akt、p-JNK3、p65、p50蛋白陽(yáng)性表達(dá)

注：與正常組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05；與低劑量組相比，aP< 0.05；與中劑量組相比，bP< 0.05。Note. Compared with the sham group, *P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05. Compared with the low dose group,aP< 0.05. Compared with the middle dose group,bP< 0.05.

3 討論

過往研究認(rèn)為腦缺血早期容易導(dǎo)致肺損傷，且肺組織會(huì)出現(xiàn)典型病理特征，主要為肺泡結(jié)構(gòu)變化、肺水腫、以及炎性浸潤(rùn)[10]。本研究采取腦中動(dòng)脈線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型，結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織出現(xiàn)腫脹伴彌漫性肺出血，毛細(xì)血管擴(kuò)張，彌漫性充血，出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)，符合肺損傷特點(diǎn)[11-12]。進(jìn)一步研究顯示模型組W/D、PMN、TNF-α、IL-1β升高，PaO2、OI均降低，表明肺組織出現(xiàn)缺氧、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激損傷，以上均提示腦缺血再灌注損傷大鼠肺損傷模型制備成功。在給予清熱化痰解毒方后，大鼠肺組織炎癥損傷有一定改善，W/D、MDA、TNF-α、IL-1β降低，PaO2、OI、SOD升高，提示清熱化痰解毒方能夠緩解肺部炎癥損傷，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而保護(hù)肺功能。

近期越來越多研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路與肺損傷密切有關(guān)[13-15]。本研究結(jié)果顯示模型組p-Akt蛋白表達(dá)降低，給予清熱化痰解毒方后p-Akt蛋白表達(dá)升高，說明清熱化痰解毒方緩解卒中大鼠肺部炎癥損傷可能與激活A(yù)kt蛋白有關(guān)。JNK信號(hào)通路激活后使JNK蛋白中Thr位點(diǎn)發(fā)生磷酸化進(jìn)而激活JNK，隨后JNK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[16]。胰腺炎肺損傷大鼠發(fā)病初期p-JNK表達(dá)明顯升高，且經(jīng)干預(yù)后其表達(dá)明顯降低，表明JNK蛋白參與胰腺炎肺損傷病理過程[17]。高氧肺損傷大鼠JNK信號(hào)通路激活可導(dǎo)致肺組織細(xì)胞大量凋亡，引發(fā)肺損傷[18]。本研究結(jié)果顯示模型組p-JNK3蛋白表達(dá)降低，清熱化痰解毒方組p-JNK3蛋白表達(dá)升高，提示清熱化痰解毒方緩解卒中大鼠肺部炎癥損傷可能與激活JNK3蛋白有關(guān)。

Caspases為細(xì)胞凋亡主要調(diào)節(jié)者，其能夠激活DNA斷裂因子引發(fā)細(xì)胞死亡，抑制Caspase-3表達(dá)可降低組織細(xì)胞凋亡，降低組織損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱化痰解毒方干預(yù)可使Caspase-3表達(dá)下降，提示清熱化痰解毒方能夠抑制Caspase-3表達(dá)進(jìn)而減輕肺炎癥損傷。NF-κB在機(jī)體內(nèi)主要以二聚體形式存在，細(xì)胞未受到外界刺激時(shí)，NF-κB與抑制物IKBa結(jié)合，細(xì)胞受到刺激后，IKBa發(fā)生磷酸化后，使NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。本研究結(jié)果顯示模型組肺組織中p65、p50蛋白表達(dá)明顯升高，而給予清熱化痰解毒方后能夠明顯降低p65、p50蛋白表達(dá)，提示清熱化痰解毒方可能通過抑制NF-κB通路改善大鼠肺部炎癥損傷。

綜上所述，本研究成功制備卒中相關(guān)性肺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)JNK3/Caspase-3和NF-κB信號(hào)通路激活，Akt通路被抑制；給予清熱化痰解毒方發(fā)現(xiàn)其能夠緩解卒中相關(guān)性肺炎大鼠肺炎癥損傷，其機(jī)制可能與抑制JNK3/Caspase-3和NF-κB信號(hào)通路、激活A(yù)kt有關(guān)。然而本研究未能直接證實(shí)清熱化痰解毒方緩解腦缺血再灌注肺損傷直接作用于肺，這還有待后續(xù)深入探究。