負載辛伐他汀的氧化石墨烯/絲素蛋白屏障膜的制備及其生物學(xué)性能

趙 彬， 武 峰， 白瑩瑩， 方 敏， 王 璐

(1. 山西醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué) 汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200)

1 前言

牙齒缺損的修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。目前，種植修復(fù)牙列缺損或缺失是口腔修復(fù)領(lǐng)域的主流技術(shù)。然而，由于患者長期缺牙或因外傷、腫瘤等導(dǎo)致的種植位點骨缺損或骨量不足是種植修復(fù)技術(shù)面臨的一大難題。針對種植位點骨量的嚴(yán)重缺損和不足，需要在種植前期或同期對牙槽骨缺損進行修復(fù)，以提高種植的成活率和修復(fù)效果。

引導(dǎo)性骨再生技術(shù)(GBR)是解決三維骨量不足的有效方法，其原理是在使用骨替代材料充填骨缺損區(qū)域的同時，將具有生物安全性的屏障膜植入，一方面阻隔成纖維細胞長入骨創(chuàng)，同時提供空間、有效的保證骨細胞優(yōu)先充滿膜下方的骨缺損間隙，促進新骨生成、重塑和改建[1]。屏障膜是引導(dǎo)性骨再生技術(shù)中的關(guān)鍵問題，其性能的優(yōu)劣直接決定著骨組織再生的效果。目前臨床最常用的屏障膜為膠原膜，但存在降解速率較快并且力學(xué)性能不足的缺陷[2]，直接影響骨組織再生及修復(fù)的效果。因此，探索和改進能夠提供良好機械強度和穩(wěn)定性，與骨缺損修復(fù)時間相適應(yīng)的屏障膜，可以使膜引導(dǎo)骨再生技術(shù)的臨床應(yīng)用更加廣泛。

絲素蛋白(SF)是一種源于蠶絲、性能優(yōu)良的生物材料，可作為生物醫(yī)用材料用于皮膚、骨、神經(jīng)等組織的修復(fù)及再生[3-5]。蠶絲經(jīng)提純后可被制成各種形態(tài)的生物材料，包括膜、多孔支架、凝膠以及無紡網(wǎng)等，其中SF膜就被廣泛應(yīng)用于引導(dǎo)性骨再生的研究。Song等[6]將SF膜覆蓋于新西蘭白兔的頭骨缺損處，結(jié)果顯示，SF膜的使用能夠顯著的促進新骨的生成。Kim等[7]將SF膜與Bio-Gide膠原膜進行對比，術(shù)后8周的結(jié)果顯示SF膜組和膠原膜組新骨生成量較為接近，考慮到膠原的免疫原性和昂貴的價格，他們認(rèn)為SF膜是除膠原膜以外的另一選擇。Ha等[8]對比了SF膜、膠原膜以及聚四氟乙烯(PTFE)膜對骨組織再生的效果。實驗結(jié)果顯示，SF膜表現(xiàn)出最佳的骨誘導(dǎo)性。

石墨烯類材料是一種新興的納米碳質(zhì)材料，具有獨特的二維結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的力學(xué)、熱學(xué)[9]以及生物學(xué)性能，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于藥物載體、組織工程、細胞成像等生物醫(yī)用領(lǐng)域的研究[10-12]。國內(nèi)外研究表明，氧化石墨烯(GO)具有豐富的含氧官能團，可以均勻的分散在高分子溶液中制備成不同種類的生物材料，GO的引入會明顯改善復(fù)合材料的理化性能甚至生物學(xué)性能[13-15]。體外細胞培養(yǎng)結(jié)果也顯示，低濃度的石墨烯在細胞水平上是一種安全的新型材料。值得注意的是，經(jīng)高分子修飾后的石墨烯類材料在誘導(dǎo)HAp 礦化以及骨修復(fù)領(lǐng)域中的相關(guān)研究揭示了其具有一定的骨誘導(dǎo)能力[16-18]。

辛伐他汀(SIM)是一種臨床常用的降脂藥物，20世紀(jì)末Mundy等[19]發(fā)現(xiàn)SIM能促進BMP-2的表達，促進新骨生成。Maeda等[20]發(fā)現(xiàn)SIM作用于MC3T3-E1細胞可上調(diào)VEGF基因的表達，能夠促進成骨細胞增殖與分化。Liu等[21]證實在Wistar大鼠拔牙窩內(nèi)局部應(yīng)用SIM可顯著上調(diào)TGF-β1、VEGF、BMP-2 mRNA基因表達水平。

理想的屏障膜應(yīng)具備足夠的機械性能、與骨組織新生速率相匹配的降解速率、良好的生物學(xué)性能并能誘導(dǎo)骨再生。在此之前，本課題組從材料的成分及結(jié)構(gòu)出發(fā)，設(shè)計并制備了GO/SF多孔支架[22]，利用GO的引入，實現(xiàn)了對材料理化性能、釋藥性能、生物降解性能的改進。GO改進后的復(fù)合材料，其各方面性能都得到了提升，如果將其制備成具有雙層結(jié)構(gòu)的膜材料，可能會在引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域取得一定成果。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，將GO/SF基生物材料以屏障膜的形式用于引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域，研究屏障膜的體外、體內(nèi)生物學(xué)性能，探討其在引導(dǎo)性骨再生領(lǐng)域的可應(yīng)用性及發(fā)展前景。

2 實驗部分

2.1 主要試劑

氧化石墨烯，南京先豐納米材料科技有限公司；家蠶生絲，江蘇省鼎盛絲綢有限公司；辛伐他汀，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；MC3T3-E1細胞，通派(上海)生物科技有限公司；SD大鼠，山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；DMEM細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，Gibco，美國；CM-DiI熒光蛋白，Invitrogen，美國；Cell Counting Kit-8，南京建成生物制劑有限公司；茜素紅 S、鈣黃綠素，Sigma，美國；其他試劑和溶劑均為分析純；實驗用水為去離子水和蒸餾水。

2.2 溶液的制備

精確稱取20 mg GO，用功率為300 W的超聲波清洗器將其分散于10 mL去離子水中，配制成濃度為2 mg/mL的GO水溶液。取50 g家蠶生絲，在煮沸的、濃度為0.05%的Na2CO3水溶液中重復(fù)處理3次，每次30 min，去離子水洗滌后于60 ℃ 烘干得到精煉蠶絲。72 ℃下將脫膠絲溶于三元溶液(氯化鈣∶乙醇∶水=1∶8∶2 摩爾比例)中1 h，去離子水透析4天，得到濃度為3.5 wt%的再生SF蛋白水溶液。

2.3 屏障膜的制備

SF膜：用去離子水將濃度為3.5 wt%的SF溶液稀釋至2 wt%，然后加入占SF質(zhì)量30%的甘油，充分?jǐn)嚢?，真空脫泡?/p>

GO/SF膜：將濃度為3.5 wt%的SF溶液與GO溶液混合，其中GO的質(zhì)量占SF質(zhì)量的0.5 wt%，用去離子水將溶液的總濃度稀釋至2 wt%，然后加入占SF質(zhì)量30%的甘油，充分?jǐn)嚢?，真空脫泡?/p>

GO/SF/SIM膜：精確稱取一定質(zhì)量的SIM，超聲分散于去離子水中，配制成10 mg/mL的分散液。將配制好的GO/SF混合溶液與SIM分散液共混，其中SIM添加量分別占SF質(zhì)量的2.5 wt%和5 wt%，充分?jǐn)嚢?，真空脫泡?/p>

將以上配置好的溶液倒入直徑為9 cm的表面皿中，于-20 ℃冷凍2 h后，真空減壓干燥約36 h得到SF膜、GO/SF膜以及GO/SF/SIM膜。

2.4 屏障膜的形貌、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)及釋藥性能測試

將GO/SF屏障膜抽真空后噴金，用JSM-7001F 型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其表面和橫截面。將凍干后的膜剪碎成粉末狀，使用日本Rigaku公司生產(chǎn)的Miniflex II衍射儀，CuKα射線，記錄樣品在2θ=5°～40°之間的衍射強度曲線。將載有SIM的屏障膜制成3 cm×3 cm的小方塊，置于50 mL PBS中，在37 ℃的恒溫振蕩水槽中進行釋放，每組重復(fù)3次。在15天的釋放周期內(nèi)，每隔一天取出3 mL溶液，同時補充3 mL新鮮的PBS，直至釋藥實驗完成。用紫外分光光度計(日立 UV-2800)測定取自不同時間點的溶液在238.5 nm處的吸光度，得到不同材料的體外釋藥曲線。

2.5 屏障膜的體外細胞相容性

將每組屏障膜裁剪成直徑約為10 mm的圓形，Co60輻照滅菌，無菌PBS沖洗3遍備用。選用第三代MC3T3-E1細胞，采用熒光染料CM-DiI進行標(biāo)記后，以1×105/孔接種于24孔板中，每隔兩天換液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于接種后7天在共聚焦顯微鏡下觀察細胞與材料的結(jié)合情況以及細胞的增殖狀態(tài)。細胞增殖與活力通過CCK-8測定，分別在細胞培養(yǎng)的1、3、5、7天，將24孔板中培養(yǎng)基吸出，材料-細胞復(fù)合物經(jīng)PBS漂洗3遍之后，每孔加入50 μL CCK-8試劑，然后加入450 μL DMEM并搖勻，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，每孔吸出100 μL至96孔板，用酶標(biāo)儀檢測450 nm下的吸光度，以6個平行樣的結(jié)果求平均值并繪制細胞生長曲線。

2.6 屏障膜用于引導(dǎo)性骨再生的體內(nèi)實驗

2.6.1 實驗動物和材料

清潔級8周齡雄性SD大鼠24只，體重為180～200 g(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。屏障膜材料：GO/SF/SIM膜、GO/SF膜、SF/SIM膜、SF膜。

2.6.2 動物模型的建立及分組

大鼠稱重，巴比妥麻醉，俯臥位將其固定于手術(shù)臺上。頭部備皮，碘伏消毒。沿頭蓋骨正中線縱向切開皮膚約3 cm，鈍性分離皮下組織，剝離骨膜，暴露頂骨。用低速鉆在生理鹽水的降溫下制備骨缺損模型，造成兩個直徑為5 mm的骨缺損區(qū)域(圖1a、b)。24只大鼠隨機分為4組，每組6只：實驗A組植入GO/SF/SIM膜、實驗B組植入GO/SF膜、實驗C組植入SF/SIM膜、對照D組植入SF膜。植入后縫合皮下組織及皮膚創(chuàng)口，分籠飼養(yǎng)。

圖 1 植入屏障膜的表觀形貌和動物模型的建立：(a,b)大鼠顱骨缺損的制備,(c,d)屏障膜植入

2.6.3 序列熒光標(biāo)記

為檢測術(shù)后不同時期新骨生成情況，采用序列熒光標(biāo)記新生骨組織[23,24]。乙醚輕度麻醉下，于術(shù)后6周時對各組大鼠皮下注射茜素紅S，9周時皮下注射鈣黃綠素，注射劑量見表1。為防止熒光標(biāo)記液流出，注射后實驗動物制動1 min左右。茜素紅在紅外光激發(fā)下呈磚紅色熒光，鈣黃綠素在藍光激發(fā)下呈黃綠色熒光。

表 1 序列熒光標(biāo)記次序及劑量

2.6.4 取材及樣本處理

術(shù)后12周處死大鼠，取顱骨標(biāo)本行肉眼觀察，乙醇梯度脫水后，用硬組織切片機(EXAKT，德國)沿標(biāo)本長軸切割，逐級打磨拋光至50 μm。用激光共聚焦顯微鏡觀察，Image Pro PLUS(Media Cybernetics，美國)圖像分析軟件測量每組標(biāo)本缺損邊緣向缺損中心方向、向顱外側(cè)方向紅色熒光標(biāo)記帶與黃綠色熒光標(biāo)記帶之間的最大垂直連線距離，即為3周時間內(nèi)該位點鈣鹽沉積的厚度，記錄并進行組間對照統(tǒng)計。腦膜側(cè)方向因熒光標(biāo)記較少，沒有統(tǒng)計意義，不作統(tǒng)計。取所有處死A、B組實驗動物的肝、脾、腎標(biāo)本觀察并進行HE染色，對局部應(yīng)用GO進行生物安全性評價。

2.6.5 統(tǒng)計學(xué)方法

圖 2 GO/SF屏障膜的掃描電鏡照片和X-射線衍射曲線：(a, b)縱截面,(c, d)橫截面,(e)X-射線衍射曲線

3 結(jié)果與討論

3.1 GO/SF屏障膜的形貌、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)與釋藥性能

GO/SF屏障膜的形貌及其聚集態(tài)結(jié)構(gòu)如圖2所示。從圖2a, b可知，該屏障膜具有典型的雙層結(jié)構(gòu)，表面具有一層致密的薄膜，內(nèi)部則為疏松的多孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)既可以起到必要的屏障作用，又可為組織的修復(fù)提供支架支撐，為骨細胞的長入提供合適的微環(huán)境。從材料的橫截面照片觀察(圖2c)，屏障膜表現(xiàn)為多孔結(jié)構(gòu)，孔壁上隨機分布著一些小孔，孔與孔之間連通性較好，這些特征有利于細胞之間的信號傳遞，毛細血管的長入，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的輸送以及細胞代謝產(chǎn)物的排泄。此外，將膜的孔壁局部放大至10 000倍，在其內(nèi)部并未發(fā)現(xiàn)有團聚的GO (圖2d)，說明GO與SF具有較好的相容性，GO可以較為均勻的分散在SF基體中。圖2e所示為GO/SF屏障膜的X-射線衍射曲線。根據(jù)前人對家蠶絲素蛋白分子構(gòu)象的研究，Silk I的主要衍射峰出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°附近，Silk II的主要衍射峰出現(xiàn)在9.1°、18.9°和20.7°附近[25,26]。

從圖2可以看出，SF膜、GO/SF復(fù)合膜均在9.1°、20.7°和24.7°附近出現(xiàn)了明顯的衍射峰，主要表現(xiàn)為Silk II結(jié)構(gòu)，內(nèi)含少量的Silk I結(jié)構(gòu)。甘油的強親水性可以誘導(dǎo)SF蛋白向更為規(guī)整的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，此時的屏障膜具有絲素蛋白最為穩(wěn)定的的Silk II結(jié)構(gòu)，對材料中藥物緩釋效果以及生物降解速率都會產(chǎn)生較好的協(xié)同效應(yīng)。圖中在10.6°出現(xiàn)明顯的特征峰歸屬于GO[27]，GO/SF膜內(nèi)部沒有出現(xiàn)10.6°附近的特征峰，說明GO在SF蛋白中分散良好。此外，GO/SF膜的XRD曲線上未出現(xiàn)新的衍射峰，說明沒有新的結(jié)晶形態(tài)產(chǎn)生。

圖 3 GO/SF/SIM屏障膜的體外釋藥曲線

GO/SF屏障膜15天內(nèi)在37 ℃環(huán)境下的體外釋放曲線如圖3所示。各組材料內(nèi)SIM的釋放均分為兩個階段，即突釋階段和緩釋階段。前3天藥物突釋現(xiàn)象明顯，GO/SF/SIM 2.5%組累計釋放百分比為(17.88 ± 1.49)%，而GO/SF/SIM 5.0%組和SF/SIM 2.5%組的累計釋放率分別達到(34.59 ± 1.52)%、(32.97 ± 1.68)%。產(chǎn)生突釋現(xiàn)象的原因在于：存在于屏障膜表面以及與膜結(jié)合較弱的SIM分子會率先從材料中脫落。從第4天開始，三組材料的釋藥曲線逐步趨于平穩(wěn)，進入緩釋階段，到達第13天時，3組材料的累計釋放率分別為(30.56 ± 1.92)%，(43.01 ± 2.42)%，(51.46 ± 1.75)%。值得注意的是，SIM的添加量對材料的釋藥性能會產(chǎn)生一定影響。在之前的研究中，筆者已經(jīng)證實，GO可使藥物釋放速率減緩，釋放時間延長，對比GO/SF/SIM 2.5%組與SF/SIM 2.5%組的釋藥曲線，可以發(fā)現(xiàn)確實如此：添加GO后，不管在突釋還是緩釋階段，GO/SF/SIM 2.5%組都表現(xiàn)出較低的藥物累計釋放率，這是GO對SF理化性能以及孔結(jié)構(gòu)的改進導(dǎo)致的。而當(dāng)進一步提高SIM添加量時，材料在釋放初期就表現(xiàn)出較高的釋藥率，甚至掩蓋了GO可以延緩釋放這一作用，這可能是由于SIM的添加量過多，在材料中已屬于飽和狀態(tài)，當(dāng)遇到PBS溶液時，過飽和的SIM分子表現(xiàn)出快速而大量的釋放。對比3種材料，筆者發(fā)現(xiàn)它們在15天內(nèi)都具有緩慢釋放藥物的效果，但GO/SF/SIM 5.0%組和SF組的突釋性過大，故其長期釋放能力不及GO/SF/SIM 2.5%組。這種持續(xù)、緩慢的藥物釋放特性可能會與生長速率較為緩慢的骨組織具有較為匹配的促進作用。

3.2 GO/SF屏障膜的體外細胞相容性

圖4為MC3T3-E1接種后7天的激光共聚焦照片以及7天培養(yǎng)周期內(nèi)MC3T3-E1細胞在屏障膜上的增長曲線。結(jié)果顯示，屏障膜在鏡下呈黑色，孔結(jié)構(gòu)清晰，經(jīng)CM-DiI標(biāo)記的細胞散發(fā)出明亮的紅色熒光。對比各組材料，可以發(fā)現(xiàn)添加GO的屏障膜，其內(nèi)部的紅色熒光亮點較多，熒光強度較強，細胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈長梭形，說明在這些樣品中的活細胞數(shù)量較多，含有適量GO的屏障膜表現(xiàn)出較好的細胞相容性。

將SIM引入材料后，可以發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部的紅色熒光亮點較空白材料組有所增加，說明從屏障膜中緩慢釋放出的SIM可以促進細胞的粘附與生長，細胞增殖較快、活力較好。當(dāng)多孔膜內(nèi)部的SIM含量不同時，細胞在材料上的增殖情況并未出現(xiàn)明顯差異，均表現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢，無大量細胞死亡，這說明兩種藥物濃度對細胞都在有效范圍之內(nèi)，具有良好的體外細胞相容性。

從MC3T3-E1細胞在4種屏障膜上的CCK-8檢測結(jié)果可以看出，在7天的培養(yǎng)過程中，細胞在各組材料上都能生長與增殖，屏障膜上的細胞數(shù)量隨時間增長而增大，表明材料無細胞毒性。具體而言，在培養(yǎng)初期，細胞在4種屏障膜上生長情況相似；而從3天開始，添加SIM的材料上，細胞數(shù)量多于未添加藥物的材料，當(dāng)培養(yǎng)時間延長至7天時，差異更加明顯，這說明SIM的添加有利于MC3T3-E1細胞的生長。

圖 4 MC3T3-E1細胞在GO/SF/SIM屏障膜上培養(yǎng)7天后的激光共聚焦照片及CCK-8 測試法獲得MC3T3-E1細胞在屏障膜上的增長曲線

3.3 GO/SF屏障膜引導(dǎo)大鼠顱骨再生的體內(nèi)實驗

3.3.1 大體觀察

術(shù)后各時間點取材前，大鼠活動自如，傷口愈合良好，顱骨區(qū)域無感染或開裂。取材后可見各組中植入的屏障膜無脫落、紅腫、滲出、壞死發(fā)生，與周圍組織結(jié)合良好。

從取出的骨組織標(biāo)本觀察可見，骨缺損邊緣與屏障膜材料邊界不清，實驗A組(GO/SF/SIM)缺損邊緣較B(GO/SF)、C(SF/SIM)、D(SF)組更為不規(guī)則，缺損范圍明顯減小，新生組織質(zhì)地較硬，其骨硬度觸感強于B、C、D組；實驗B、C組之間大體觀察無明顯差異，實驗A、B、C組的修復(fù)效果優(yōu)于對照D組。4組屏障膜在大鼠體內(nèi)均發(fā)生了不同程度的降解，對比C、D兩組材料，添加了GO的A、B兩組僅被小部分降解，仍能完整覆蓋缺損區(qū)，維持較好的屏障作用。

3.3.2 序列熒光標(biāo)記測定新生骨組織

茜素紅 S與鈣黃綠素對骨組織中的鈣具有較強的標(biāo)記能力。為了考察新生骨組織在不同時期的生長情況，筆者分別將茜素紅 S和鈣黃綠素于術(shù)后6、9周經(jīng)腹腔注射至大鼠體內(nèi)，通過這兩種標(biāo)記物發(fā)出的熒光對不同時期新生的骨組織進行動態(tài)的監(jiān)測。

如圖5所示，分別測量了各組向缺損中心方向(V向)和向顱外側(cè)方向(H向)紅綠熒光標(biāo)記帶之間的最大垂直連線距離。具體而言，向缺損中心方向(V向)，各組材料植入后都有一定的新骨形成。實驗A組的骨愈合量與其他三組具有顯著性差異，實驗B組及C組均與對照D組表現(xiàn)出顯著性差異。上述結(jié)果表明，在V向的新骨形成過程中，GO或SIM單獨使用均可促進骨組織再生，而SIM與GO聯(lián)合使用時具有交互作用，會對骨缺損的愈合產(chǎn)生明顯的協(xié)同促進效果。向顱外側(cè)方向(H向)的新骨生成不如V向表現(xiàn)得明顯，實驗A、B、C三組的骨愈合量與對照D組具有顯著性差異，但A、B、C三組之間并無顯著性差異。這說明，在H向的新骨形成過程中，單獨使用SIM或GO可以略微提高骨愈合量，但GO與SIM之間的交互作用不顯著，不能認(rèn)為同時使用GO與SIM對骨缺損有協(xié)同促進作用。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與不規(guī)則顱骨形態(tài)有關(guān)系，在自然生長狀態(tài)下，顱骨向缺損中心方向的生長量要遠大于向顱內(nèi)外側(cè)方向的生長量，藥物干預(yù)可能對改變顱骨固有生長速度的規(guī)律并不顯著。

圖 5 Ⅰ：序列熒光標(biāo)記標(biāo)本切片的激光共聚焦照片(12周)：(a) GO/SF/SIM, (b) GO/SF, (c) SF/SIM及(d) SF

3.3.3 局部應(yīng)用GO在動物體內(nèi)的生物安全性評價

GO的體內(nèi)外生物安全性一直是個有爭議的問題，本實驗取術(shù)后12周大鼠實質(zhì)器官肝、脾、腎進行HE染色，以評價GO在動物體內(nèi)的生物安全性。圖6為植入屏障膜12周時大鼠肝、脾、腎3個重要臟器的HE染色圖片，均未見明顯異常炎性細胞浸潤及異常組織細胞結(jié)構(gòu)，同時未發(fā)現(xiàn)有沉積的GO顆粒，證明局部應(yīng)用低濃度的GO復(fù)合材料對大鼠肝、脾、腎臟器短期(3個月)內(nèi)不會造成損害。

圖 6 植入GO/SF/SIM屏障膜12 w時大鼠(a)肝臟,(b)脾臟,(c)腎臟的HE染色照片(×100)

4 結(jié)論

以GO和SF為原材料，同時負載SIM，制備了具有雙層結(jié)構(gòu)的載藥屏障膜，并研究了屏障膜的體外細胞相容性及其作為引導(dǎo)性骨膜的修復(fù)效果。結(jié)果表明，GO/SF屏障膜具有表面致密、內(nèi)部疏松的形貌，同時聚集態(tài)結(jié)構(gòu)為穩(wěn)定的Silk II結(jié)構(gòu)，載有SIM的屏障膜在15天內(nèi)表現(xiàn)出緩釋特性。在體外，GO/SF屏障膜可以很好的支持MC3T3-E1細胞的粘附與增殖，GO與SIM的引入都可以促進骨細胞的生長。植入大鼠體內(nèi)的屏障膜具有促進骨缺損修復(fù)的能力，在向缺損中心方向的新骨形成過程中，SIM與GO的聯(lián)合使用對骨缺損的愈合產(chǎn)生了明顯的協(xié)同促進作用。此外，在體內(nèi)局部應(yīng)用低濃度的GO復(fù)合材料是安全的，對大鼠重要臟器短期(3個月)內(nèi)不會造成損害。GO/SF/SIM復(fù)合屏障膜具有穩(wěn)定的理化性能、良好的體內(nèi)外生物相容性，并對骨缺損有較好的修復(fù)效果，同時制備技術(shù)簡單，原材料成本較低，有望作為新型屏障膜材料應(yīng)用于GBR技術(shù)中。