海藻糖氧釩對小鼠胃腸道的氧化損傷以及Vc和GSH的抗氧化保護作用

魏 倩，MUHAMMAD Umar，姜蘋哲，李曉丹，劉奇奇，邢曙光，羅文亞，楊星楷，李明剛

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

隨著近年來人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年升高[1]。糖尿病是一種由胰島素分泌不足或機體對胰島素敏感性降低而引發(fā)的慢性代謝疾病[2]。釩是人體必需的微量元素之一，因其具有“胰島素樣”作用，可在一定程度上調(diào)節(jié)糖代謝而具有抗糖尿病的功能[3]。然而，釩化合物往往也會引發(fā)一些毒副作用，主要的是消化道反應(yīng)，如腹瀉、脫水、體質(zhì)量減輕等[4]。有研究報道，釩的毒副作用機制可能與其引起機體自由基堆積、抗氧化酶活性降低、氧化損傷增強等有關(guān)[5]。

還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)是體內(nèi)重要的抗氧化劑，其含量主要通過谷胱甘肽還原酶(GSR)、谷胱甘肽合成酶(GSS)、谷氨酸半胱氨酸連接酶(γ-GCL)和部分谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)進行調(diào)節(jié)，這些酶共同構(gòu)成了谷胱甘肽/谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSH/GSTs)通路[6]。維生素C(vitamin C, Vc)是細胞內(nèi)外化學(xué)反應(yīng)的還原劑，也是一種水溶性低分子抗氧化物質(zhì)[7]。

海藻糖氧釩(vanadyl trehalose, VT)最初是由BARRIO等[8]合成的一種新型有機釩化合物。作者課題組前期采用類似方法合成了VT，并發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的血糖水平，緩解多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕的糖尿病癥狀[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，VT對昆明小鼠的主要毒性靶器官是胃和十二指腸[10]。本研究觀察VT對實驗小鼠胃和十二指腸的GSH(抗氧化非酶類)含量以及GSH-Px(抗氧化酶類)活性的影響，并測定GSH/GSTs通路相關(guān)基因表達，以闡明VT是否通過影響GSH而發(fā)揮其毒性作用，并探索外源添加抗氧化劑Vc和GSH對其解毒的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性昆明小鼠30只，5周齡，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院中心(動物許可證編號SCXK-2007-005)。動物房維持溫度(20±2)℃，濕度(50±5)%，光暗周期為12 h∶12 h，無強烈聲光刺激。所有動物適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周，期間自由進食正常飼料并自由飲用自來水。

1.2主要試劑硫酸氧釩購自天津阿法埃莎化學(xué)有限公司；海藻糖購自天津西馬克技術(shù)有限公司；無水乙醇購自天津化學(xué)試劑供銷公司；GSH購自北京索萊寶公司；Vc購自美國Sigma公司；GSH及GSH-Px活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus購自TaKaRa；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal PreMix Plus SYBR Green購自北京天根生化科技有限公司；引物全部委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3藥物制備海藻糖氧釩的合成按照BARRIO等[8]的方法。向10 mL的海藻糖溶液(0.4 mol/L)中，逐滴滴加硫酸氧釩溶液(0.1 mol/L)，然后使用NaOH溶液(2 mol/L)將混合溶液的pH值調(diào)節(jié)至13。該棕色混合溶液在室溫下密封放置12～24 h，加入無水乙醇，逐漸有固體析出，過濾收集固體并用無水乙醇洗滌。產(chǎn)物用NaOH固體干燥并置于干燥器中保存。VT、Vc和GSH使用時在蒸餾水中溶解并當天配制。

1.4實驗分組及給藥將30只雄性昆明小鼠隨機分為5組，進行如下處理：A組：等體積生理鹽水灌胃；B組：125 mg/(kg·d)VT灌胃；C組：150 mg/(kg·d)Vc灌胃1 h后，再用125 mg/(kg·d)VT灌胃；D組：150 mg/(kg·d)GSH灌胃1 h后，再用125 mg/(kg·d)VT灌胃；E組：150 mg/(kg·d)Vc+150 mg/(kg·d)GSH灌胃1 h后，再用125 mg/(kg·d)VT灌胃；各組連續(xù)給藥15 d。

1.5取材及樣品制備末次給藥完畢后，各組小鼠禁食不禁水24 h，以頸椎脫臼法處死小鼠，迅速解剖，取胃、十二指腸在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗2～3次，用濾紙吸干。各樣品一式兩份，一份裝于EP管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；另一份裝于凍存管中液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

組織勻漿液制備：分別稱取保存于-20 ℃的胃、十二指腸組織(0.2～1 g)按1∶9(g/mL)加入9倍預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(生理鹽水)于研缽中，在冰浴條件下制備勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min，取上清液在4 ℃冰箱冷藏或-20 ℃冰箱冰凍備用。

1.6指標測定GSH含量采用DTNB法測定，GSH-Px活力采用GSH氧化法測定。以上各指標的測定和計算嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.7實時熒光定量PCR檢測參照RNAiso Plus說明書的步驟提取胃、十二指腸組織總RNA。通過微量紫外分析儀(Nano Drop 2000)檢測總RNA濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。RNA提取物-80 ℃保存?zhèn)溆?。各樣品總RNA采用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板按照SuperReal PreMix Plus SYBR Green說明書操作，加入相關(guān)試劑及引物以最終反應(yīng)體積為20 μL進行PCR擴增。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)；72 ℃檢測信號。以CFX96 PCR熱循環(huán)儀分析軟件，將Ct值按公式2-△△Ct計算并用于統(tǒng)計分析。

表1Real-timePCR引物序列

Tab.1 Primers sequence for Real-time PCR

基因序列GCLCF:5′- CTACCACGCAGTCAAGGACC -3′R:5′- CCTCCATTCAGTAACAACTGGAC -3′GSSF:5′- AAAGCAGGCCATAGACAGGG -3′R:5′- TGAATGGGGCATACGTCACC -3′GSRF:5′- GCGTGAATGTTGGATGTGTACC -3′R:5′- GTTGCATAGCCGTGGATAATTTC -3′GSTpiF:5′- ATGCCACCATACACCATTGTC -3′R:5′- GGGAGCTGCCCATACAGAC -3′GAPDHF:5′- TGACCTCAACTACATGGTCTACA -3′R:5′- CTTCCCATTCTCGGCCTTG -3′

2 結(jié) 果

2.1小鼠胃、十二指腸組織GSH含量的比較5組小鼠干預(yù)15 d后，胃組織GSH含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.25，P<0.01)，B組顯著低于A組(P<0.01)，C、D、E組較B組顯著提高(均為P<0.01)；E組顯著高于C、D組(P=0.008，P=0.023)，且C、D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.538)，E組與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.405，表2)。5組間小鼠十二指腸GSH含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=76.17，P<0.01)，與A組相比，B組十二指腸的GSH含量顯著降低(P<0.01)，而C、D、E組比B組顯著提高(均為P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.154)；E組顯著高于C組和D組(P=0.003，P=0.047)，但仍顯著低于A組(P=0.035，表2)。

表2各組小鼠胃、十二指腸組織GSH含量的比較

Tab.2 Comparison of GSH content in the stomach and duodenum of mice in each group

μmol/g prot)

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與E組比較，△P<0.05。

2.2小鼠胃、十二指腸組織GSH-Px活性的比較5組間小鼠胃組織GSH-Px活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.44，P<0.01)，與A組相比，B組GSH-Px活性顯著下降(P<0.01)，C、D、E組比B組明顯升高(均為P<0.01)，C組與D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.923)，E組顯著高于C組和D組(P=0.037，P=0.043)，E組與A組間差異不顯著(P=0.770，表3)。5組間小鼠十二指腸GSH-Px活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=340.39，P<0.01)，B組十二指腸的GSH-Px活性比A組顯著降低(P<0.01)；與B組相比，C、D、E組則顯著提高(均是P<0.01)，且E組顯著高于C組與D組(P=0.003，P=0.018)，但C、D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.325)；E組仍低于A組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008，表3)。

表3各組小鼠胃、十二指腸組織GSH-Px活性的比較

Tab.3 Comparison of GSH-Px activity in the stomach and duodenum of mice in each group

prot)

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與E組比較，△P<0.05。

2.3小鼠胃組織GSH/GSTs通路相關(guān)基因mRNA表達變化各組連續(xù)處理15 d后，5組間小鼠胃組織的各基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(GCLC：F=32.94，P<0.01；GSS：F=22.73，P<0.01；GSR：F=20.22，P<0.01；pi-谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTpi)：F=27.39，P<0.01)；B組小鼠胃組織的GCLC、GSS、GSR、GSTpi表達均比A組顯著下調(diào)(均為P<0.01)，C、D、E組的GCLC、GSS、GSR表達比B組明顯升高(均為P<0.05)。E組GCLC、GSS、GSR表達顯著高于C、D組(均為P<0.05)，但與A組無顯著差異，且C、D組間差異不明顯(均為P>0.05)；GSTpi在C、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且其水平都達到了正常對照組(A組)水平(均為P>0.05，圖1)。

圖1小鼠胃組織中GSH/GSTs通路相關(guān)基因mRNA表達的比較

Fig.1 The mRNA expression of GSH/GSTs pathway related gene in the stomach of mice

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與E組比較，△P<0.05。

2.4小鼠十二指腸中GSH/GSTs通路相關(guān)基因mRNA表達變化5組間小鼠十二指腸中各基因表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(GCLC：F=126.74，P<0.01；GSS：F=21.86，P<0.01；GSR：F=26.41，P<0.01；GSTpi：F=41.05，P<0.01)；與A組相比，B組小鼠十二指腸中的GCLC、GSS、GSR和GSTpi表達均顯著下調(diào)(均為P<0.01)，C、D、E組比B組有顯著上升(均為P<0.05)；與C、D組相比，E組的GCLC、GSS、GSR表達分別顯著升高(均為P<0.05)，但只有GSR表達恢復(fù)到對照組(A組)的水平(P=0.954)。C、D組之間的GCLC、GSS、GSTpi表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，但C組GSR表達明顯高于D組(P=0.035)；C、D、E組間GSTpi表達無統(tǒng)計學(xué)差異且都顯著低于對照組(A組)(均為P<0.05，圖2)。

3 討 論

氧化應(yīng)激是機體遭受到各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生過多，機體無法及時清除，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。ROS包括超氧陰離子(·O2-)、羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等；在生理條件下，釩主要以+5、+4兩種價態(tài)形式存在，在其轉(zhuǎn)化過程中伴隨有ROS產(chǎn)生。V4+通過fenton反應(yīng)生成V5+，并產(chǎn)生大量的·OH。釩化合物刺激細胞后，使胞內(nèi)p47-phox蛋白質(zhì)磷酸化，從而激活NADPH氧化酶，并在細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的·O2-[11]。機體存在兩類抗氧化系統(tǒng)：一類是酶抗氧化系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等；另一類是非酶抗氧化系統(tǒng)，包括Vc、維生素E、GSH、類胡蘿卜素和硒(Se)等[12]。

本研究采用連續(xù)灌胃給藥處理15 d后，結(jié)果顯示VT給藥組小鼠胃、十二指腸GSH含量及GSH-Px活性均低于對照。分析主要原因可能有：①五價釩轉(zhuǎn)化為四價釩的過程中GSH被氧化而消耗；②釩和GSH有高親和力，導(dǎo)致二者直接結(jié)合；③釩誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS氧化GSH而使機體細胞中GSH水平降低。體內(nèi)GSH的缺乏或耗竭均會加劇多種化學(xué)物質(zhì)的毒性作用，增加氧化損傷[13]。小鼠灌服VT使谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性降低，原因可能是其釩離子與-SH有很強的親和力，與GSH-Px活性中心的-SH結(jié)合導(dǎo)致活力降低；此外，可能還與釩易與GSH-Px的底物GSH結(jié)合而使GSH-Px活力降低有關(guān)。

圖2小鼠十二指腸中GSH/GSTs通路相關(guān)基因mRNA表達的比較

Fig.2 The mRNA expression of GSH/GSTs pathway related gene in the duodenum of mice

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與D組比較，◇P<0.05；與E組比較，△P<0.05。

灌服VT使小鼠胃腸道抗氧化系統(tǒng)損傷并導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。FOLARIN等[14]研究發(fā)現(xiàn)釩引起小鼠大腦的GSH含量及GSH-Px活性下降。也有文獻報道釩可降低大鼠肝細胞的GSH含量[15]。本研究結(jié)果表明，外源補充Vc和GSH均能增加小鼠胃、十二指腸GSH含量及GSH-Px活性，但只有兩者聯(lián)合使用時，才能使胃中GSH含量及GSH-Px活性恢復(fù)到正常對照組水平，表明VT對十二指腸GSH含量及GSH-Px活性的影響較胃組織更明顯。外源性補充GSH可直接增加體內(nèi)GSH含量，有利于清除自由基，并與親電子復(fù)合物在非酶或谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的作用下產(chǎn)生交聯(lián)復(fù)合物，最終形成硫醚氨酸排出體外，增加細胞解毒功能，加快毒副產(chǎn)物的排泄速率，減弱釩的毒性。WANG等[16]報道外源補充GSH可加速小鼠體內(nèi)砷的排泄，減輕砷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而降低砷毒性。外源性補充Vc可增加膠原蛋白合成和修復(fù)，保護黏膜細胞，維持胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性；還可快速與·O2-、H2O2和·OH反應(yīng)生成半脫氫抗壞血酸以清除或減少這些自由基，從而防止或減輕細胞發(fā)生氧化損傷。亦有研究報道，Vc可提高腸上皮細胞抗氧化能力，減低其氧化損傷[17]。

GSH/GSTs是動物重要的抗氧化和解毒系統(tǒng)，GSH合成(GCLC、GSS、GSR)和分解代謝相關(guān)酶基因(GSTpi)構(gòu)成了一個完整的GSH/GSTs 功能系統(tǒng)和較為完整的通路[6]。在機體內(nèi)還原型GSH以氨基酸為底物在γ-GCL和GSS的催化下合成，其中，γ-GCL是限制酶，GCLC是該酶的催化亞基；同時，也可在GSR和NADPH作用下使氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原生成GSH[18]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，VT給藥組胃和十二指腸中的GCLC、GSS和GSR基因表達均下調(diào)，表明VT對胃和十二指腸產(chǎn)生一定毒性，造成抗氧化功能障礙，干擾了相關(guān)基因的正常表達。外源補充Vc和GSH及兩者聯(lián)用都能提高GCLC、GSS和GSR基因mRNA表達，且只有兩者聯(lián)用組的胃組織的表達才可恢復(fù)到正常對照組水平，這與對GSH含量及GSH-Px活性的影響相一致。推測可能是外源添加Vc和GSH增加了體內(nèi)抗氧化能力，保護胃和十二指腸的功能并降低了VT毒副作用對相關(guān)基因表達的影響。值得注意的是，補充Vc組在十二指腸中的GSR表達量顯著高于補充GSH組，且兩者聯(lián)用使其表達可恢復(fù)到正常對照組水平，可能是Vc比GSH能更有效提高GSR活性，增加了體內(nèi)GSH量，再與GSH聯(lián)用，使細胞功能恢復(fù)到了正常水平[17]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于Ⅱ相代謝解毒酶的同工酶家族，具有清除體內(nèi)自由基和解毒的雙重功能。GSTpi是GSTs家族重要成員，可參與多種內(nèi)、外源性物質(zhì)的代謝，清除有害物質(zhì)，降低機體的氧化損傷，對細胞具有保護作用[19]。本研究中，因VT對胃和十二指腸產(chǎn)生毒性，損傷了細胞的正常功能，從而使GSTpi表達下降。外源補充Vc和GSH及兩者聯(lián)用都使GSTpi表達有所增加，但只有在胃組織中與正常對照組水平相當，說明VT對十二指腸的影響更大。

本研究中，分別單獨補充Vc和GSH雖然比VT給藥組對各指標有改善效果，但仍沒達到正常對照組水平。一方面可能是單獨使用Vc和GSH其作用有局限性；另一方面也可能與補充量不足有關(guān)。當Vc和GSH聯(lián)用時，結(jié)果使一些指標恢復(fù)到正常水平，效果優(yōu)于Vc和GSH單獨使用，說明兩者除能獨自發(fā)揮抗氧化作用外，還具有一定的協(xié)同作用。在體內(nèi)Vc和GSH構(gòu)成耦聯(lián)的氧化還原對，當Vc被氧化成脫氫Vc時，GSH依賴性脫氫Vc還原酶的活性，在維持Vc生理循環(huán)上發(fā)揮重要作用，而Vc也可使氧化型谷胱甘肽(GSSH)還原成GSH，使其增加含量并幫助其發(fā)揮作用[20]。因此，需進一步研究Vc和GSH單用的有效劑量以及兩者聯(lián)用的合理配比，并進一步闡明其所涉及的信號通路的變化機制。