茶多酚對糖尿病心肌病大鼠心功能的保護作用及其機制

鄭夢瑩，李 燕，劉敬禹

(1. 錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，遼寧錦州 121000；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453100)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是誘發(fā)糖尿病人群心力衰竭的主要危險因素[1]。DCM被定義為心肌的結構和功能異常，獨立于冠狀動脈疾病或高血壓[2]。DCM的潛在細胞和分子機制仍然知之甚少，是多因素且復雜的病理生理學過程，涉及氧化應激、神經(jīng)激素激活、炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)受損、線粒體損傷、心肌細胞凋亡和自噬[3]。盡管藥物可控制血糖并改善心功能不全，但其發(fā)病率卻不斷上升[4]。因此，需要進一步探索DCM的潛在發(fā)病機制并開發(fā)新藥。

綠茶中含有許多稱為兒茶素的多酚，研究發(fā)現(xiàn)綠茶多酚(green tea polyphenol, GTP)具有清除活性氧自由基的作用，能改善心臟肥大和纖維化以及動脈粥樣硬化的發(fā)展[5]。GTP是一種有效的抗氧化化合物，已有實驗研究證明，其比維生素C、E，迷迭香提取物和姜黃素有更強的抗氧化保護作用[6]。在某些條件下，GTP可以改善DNA的自由基損傷。盡管有證據(jù)表明GTP參與改善心臟相關疾病，但很少有關于GTP和DCM的研究報道。

巨自噬(以下稱為自噬)是在應激狀態(tài)下細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。一般認為自噬對維持正常的心臟功能和形態(tài)學至關重要[7]。在基線時，自噬能清除蛋白聚集和損傷；在缺血時，自噬被激活使代謝基質再循環(huán)以維持心肌生存[8]。據(jù)報道，在OVE26小鼠心臟中自噬被抑制，而采用二甲雙胍治療可恢復OVE26小鼠的心臟自噬，有效預防心肌損傷[9-10]。這表明自噬可能在1型糖尿病模型的心臟中起保護作用。研究表明，GTP可誘導自噬[11]，但自噬在GTP預防DCM中的作用尚不清楚。

因此，本研究探討了GTP對DCM的體內(nèi)心臟保護作用；擬通過建立DCM模型，并用GTP或氯喹(CQ，自噬抑制劑)進行相應的治療處理以闡明GTP對DCM的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物75只雄性SD大鼠，體質量(160±20)g，6～8周齡。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，按照錦州醫(yī)科大學動物保健委員會制定的動物護理原則進行飼養(yǎng)。

1.2 Ⅰ型糖尿病(T1DM)誘導和實驗分組按體質量給予大鼠腹膜內(nèi)注射60 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ，0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液稀釋)誘導建模T1DM?？崭寡?16.8 mmol/L表示糖尿病誘導成功，T1DM造模成功率62.5%，死亡率11.3%。

將誘導成功的大鼠(47只)隨機分為糖尿病組(DM，n=12)，GTP組(DM+GTP，n=12)，GTP+CQ組(DM+GTP+CQ，n=11)，CQ組(DM+CQ，n=12)。另設正常對照組(NG，n=15)，未注射STZ，僅注射檸檬酸緩沖液。各組分別灌胃14周。NG組和DM組在相同時間灌胃等體積蒸餾水，CQ組灌胃CQ溶液[Sigma公司，50 mg/(kg·d)，溶于9 g/L生理鹽水中]。GTP(批號Y1502，美國Sigma公司)溶于蒸餾水中，根據(jù)文獻[12]按400 mg/(kg·d)GTP灌胃，而GTP+CQ組灌胃等量的CQ和GTP混合溶液。

1.3血壓和超聲心動圖檢查灌胃14周，用動物全身體積描記器(BP2000，美國Apex公司)測量心率(HR)、收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP)。吸入30 mL/L異氟烷麻醉大鼠后，使用Philips IE33超聲系統(tǒng)(Philips IE33，Philips Medical Systems, Holland)測量經(jīng)胸超聲心動圖，并從二維超聲心動圖獲得相關心動參數(shù)。所有的測量重復6～8個連續(xù)的心動周期。

1.4生化分析檢測測量血壓和超聲心動圖檢查后，自大鼠股動脈采血后，處死。稱體質量(BW)，測量脛骨長度(TL)。取心臟組織并-80 ℃儲存。采用Beckman CX-7生化自動分析儀(美國CA公司)檢測脂代謝相關指標。使用ELISA試劑盒(北京康肽生物科技有限公司)檢測血清和尿白蛋白和血清血紅蛋白A1c(HbA1C)水平。

1.5HE染色及透射電子顯微鏡(TEM)觀察將心臟沿心室中間水平橫向平分，取部分左心室組織，常規(guī)處理制成4 μm切片，HE染色，Eclipse 80i顯微鏡(日本尼康公司)觀察形態(tài)學變化并保存圖像；部分左心室組織常規(guī)制作電鏡切片，電子顯微鏡(JEM-2000EX TEM，日本東京)下觀察并拍攝圖像。

1.6Westernblot檢測取左心室心肌組織提取組織蛋白，20 μg上樣進行凝膠電泳(100～200 g/L Tricine梯度)后，轉至纖維蛋白膜，再分別滴加一抗：兔多克隆LC3-Ⅱ(1∶500)，p-GSK3β(1∶200)，LC3-Ⅰ(1∶500)，BECN1(1∶200)，MYC(1∶200)，SQSTM1(1∶100)，p-MTOR(1∶200)，MTOR(1∶200)，CTNNB1(1∶100)，GSK3β(1∶200)，TCF4(1∶500)抗體和抗GAPDH兔多克隆(1∶1 000)，4 ℃過夜后，滴加IgG辣根過氧化物酶二抗孵育后，常規(guī)顯色、觀察。將靶向條帶歸一化至GAPDH以確定目的蛋白的相對表達。

2 結 果

2.1各組大鼠的一般特征DM組大鼠血糖和HbA1C水平較NG組顯著升高(P<0.05)，而血清胰島素和體重水平較NG組顯著降低(P<0.05)。GTP組的尿白蛋白和血清甘油三酯濃度較DM組顯著降低(P<0.05)。此外，不同組間血清白蛋白、TC濃度、心率和血壓水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

表1各組大鼠的一般特征

Tab.1 General characteristics of the rats

參數(shù)NG組(n=15)DM組(n=12)GTP組(n=12)GTP+CQ組(n=11)CQ組(n=12)空腹血糖(mmol/L) 5.80±1.2021.50±2.60?21.40±1.90?23.40±3.50?22.20±3.00?血漿胰島素(μU/mL)4.20±0.502.60±0.70?2.80±0.70?2.50±0.40?2.70±0.60?HbA1C(%)3.10±0.406.40±0.70?3.50±0.60#6.30±0.70?△6.70±0.60?△血清白蛋白(g/L)29.70±1.3027.20±2.6029.80±4.80#28.40±2.3031.00±2.90#尿白蛋白(mg/L)76.20±6.20635.90±42.60?84.50±6.80#642.00±36.60?△650.30±48.20?△TG(mmol/L) 0.71±0.201.26±0.21?0.80±0.13#1.42±0.14?#△1.34±0.16?△TC(mmol/L)2.52±0.802.61±0.332.55±0.912.62±0.492.64±0.30SBP(mmHg)132.00±8.10128.60±7.90132.80±8.40125.30±9.20130.10±5.50DBP(mmHg)70.10±4.0067.30±5.2068.50±5.5069.80±6.1073.10±3.30MAP(mmHg)90.30±4.0088.10±5.7090.00±5.2089.00±3.2092.40±2.60HR(次/min)380.00±15.00372.00±23.00377.00±22.00374.00±26.00378.00±10.00體質量(g)357.20±8.40247.00±4.50?243.10±10.80?250.10±12.90?247.60±6.50?

與NG組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05；與GTP組比較，△P<0.05。

2.2GTP改善了T1DM大鼠的心臟功能各組代表性二維超聲心動圖見圖1所示。與對照組相比，左心室舒張末期/收縮期直徑(LVED與LVEDd)、左心室收縮期和舒張期室間隔直徑(LVIVs與LVIVd)、舒張期左心室后壁厚度(LVPWD)及左心室舒張末期容積/收縮期容積(EDV/ESV)水平較高，而左心室射血分數(shù)(EF%)、左心室射血分數(shù)不足(FS%)和早期與晚期二尖瓣血流速度峰值比(E/A)比值減少，表明糖尿病大鼠的心臟功能受損；采用GTP治療14周可改善心臟功能受損，但加入CQ治療逆轉了GTP對心臟功能的保護作用(圖2)。

圖1 各組大鼠代表性二維超聲心動圖Fig.1 Representative two-dimensional echocardiograms of each groupA:NG組;B:DM組;C:GTP組;D:GTP+CQ組;E:CQ組。

圖2各組大鼠二維超聲心動參數(shù)的比較

Fig.2 Two-dimensional echocardiographic parameters of each group

A：左心室舒張末期/收縮期直徑；B：左心室收縮期和舒張期室間隔直徑；C：左心室舒張末期容積/左心室收縮期容積；D：左心室射血分數(shù)和左心室射血分數(shù)不足所占比例；E：舒張期左心室后壁厚度；F：早期和晚期二尖瓣血流速度峰值比。與NG組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05；與GTP組比較，△P<0.05。

2.3GTP減輕T1DM大鼠的心臟肥大、纖維化和超微結構異常HE染色顯示，DM組的心肌組織學發(fā)生顯著改變，如心肌細胞紊亂、細胞間邊界不明顯和細胞核大小不規(guī)則(圖3)。透射電鏡分析顯示，NG組大鼠心臟肌原纖維排列整齊，有規(guī)則連續(xù)的肌節(jié)，肌原纖維間線粒體縱向分布正常；相反，DM組的左心室組織表現(xiàn)出破壞的肌原纖維和錯位和聚集的線粒體(圖4)。這些發(fā)現(xiàn)表明糖尿病大鼠的心臟結構受損。與DM組相比，GTP顯著改善了糖尿病大鼠異常的心肌組織形態(tài)和纖維化(圖3、圖4)。

HE染色和透射電鏡分析顯示，與GTP + CQ組相比，CQ組的心臟組織結構存在顯著惡化(圖3、圖4)。此外，CQ逆轉了GTP對心臟功能的保護作用(圖5)?？傊@些結果顯示，GTP可能通過調節(jié)自噬來改善糖尿病大鼠受損的心臟功能和組織學異常。

圖3大鼠心肌組織HE染色結果

Fig.3 HE staining of left ventricular tissue (×400)

A：NG組；B：DM組；C：GTP組；D：GTP+CQ組；E：CQ組。

2.4GTP促進T1DM大鼠心肌細胞自噬與NG組相比，DM組中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和BECN1表達顯著降低(P<0.05)，SQSTM1水平顯著增加(P<0.05)；同時，CQ組的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、BECN1和SQSTM1蛋白水平與DM組相比無明顯變化，表明糖尿病大鼠心肌細胞自噬體形成受損；此外，與DM組相比，GTP治療增加了LC3-Ⅱ/Ⅰ比值和BECN1蛋白表達水平，并降低了SQSTM1的蛋白水平；值得注意的是，CQ和GTP聯(lián)合治療可進一步增加LC3-Ⅱ/Ⅰ和SQSTM1的蛋白水平(圖5)?？傊?，這些結果表明，GTP可部分恢復STZ誘導的糖尿病大鼠心肌細胞中的自噬缺陷。

圖4 各組大鼠代表性左心室組織的TEM觀察結果Fig.4 Representative TEM of left ventricular specimens in each group (×12000)A:NG組;B:DM組;C:GTP組;D:GTP+CQ組;E:CQ組。

圖5Westernblot檢測不同組間T1DM大鼠心肌細胞自噬蛋白的表達變化

Fig.5 Western blot analysis of autophagic indicators among different groups (n=6)

與NG組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05；與GTP組比較，△P<0.05。

2.5GTP抑制T1DM大鼠心肌細胞中β-catenin/TCF4/GSK-3β和MTOR信號DM組β-catenin、TCF4和MYC的蛋白表達均較NG組顯著上調(P<0.05)，并且p-GSK3β/GSK3β和p-MTOR/MTOR的比值較NG組顯著提高(P<0.05)。與DM組相比，GTP組的β-catenin、TCF4和MYC蛋白表達水平及p-GSK3β/GSK3β和p-MTOR/MTOR的比值均顯著降低(P<0.05，圖6)。

3 討 論

最近，有多篇研究報道認為，GTP的一些有益保護作用可能是通過調節(jié)自噬來介導的[13]。然而，GTP對自噬的影響似乎是組織特異性的。在巨噬細胞中，GTP促進內(nèi)毒素誘導的HMGB1(一種晚期致死性炎癥因子)的自噬性降解[14]。GTP的自噬促進作用也發(fā)生在牛主動脈內(nèi)皮細胞中，并解釋其降低脂質積聚[13]。然而，在人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞中，GTP通過下調自噬減少UVB光誘導的視網(wǎng)膜損傷[15]。雖然GTP對心肌細胞損傷也有保護作用，但尚不清楚是否調節(jié)心臟自體吞噬來介導這些效應。本研究發(fā)現(xiàn)，GTP通過調節(jié)β-catenin/TCF4/GSK-3β通路和MTOR通路可恢復DCM大鼠受損的心肌細胞自噬。

DCM的特征是左心室肥厚、心肌重塑和舒張/收縮功能障礙及心肌纖維化，最終進展為心力衰竭[16]。先前的研究已經(jīng)證明GTP與心臟肥大和纖維化有關[17]。在心力衰竭患者和動物模型中，補充GTP改善了心臟功能障礙和結構異常[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，用GTP治療改善了心臟舒張和收縮功能并減輕了T1DM大鼠心臟中的心室肥大和纖維化，與既往的研究結果一致。

心臟組成性自噬對維持正常心臟結構和功能是必要的。在成年小鼠中，心臟特異性缺乏自噬相關的Atg5引起心臟功能障礙并破壞心臟結構[19]。本研究中，T1DM大鼠心臟中的自噬受到抑制，自噬體減少，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、BECN1蛋白水平下降，并增加SQSTM1蛋白表達的水平。

圖6 不同組間糖尿病大鼠心臟中的β-cate-nin/TCF4/GSK-3β和MTOR信號蛋白的表達
Fig.6 Western blot analysis of the proteinexpress-sions of β-catenin/TCF4/GSK-3β and MTOR sig-naling pathway in different groups (n=6)
與NG組比較,?P<0.05;與DM組比較,#P<0.05;與GTP組比較,△P<0.05。

GTP可以在不同條件下誘導自噬，在雄性C57BL/6小鼠的肝臟缺血再灌注損傷中，GTP預處理顯著增強自噬通量并減弱再灌注損傷[20-21]。這提示用GTP治療可以恢復體內(nèi)受損的心臟自噬。此外，用CQ抑制劑可消除GTP對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用，并增加LC3-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平。CQ為自噬體-溶酶體抑制劑，自噬體積累和LC3-Ⅱ/Ⅰ水平增加表明GTP促進自噬的形成。上述數(shù)據(jù)表明，糖尿病引起的心臟自噬抑制可能在DCM的發(fā)病機制中起作用，而GTP可能通過增強自噬來防止DCM。

有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與心臟重塑、心肌梗塞、心力衰竭和心律失常的病理過程有關[22]，其信號通路的過度激活牽涉DCM的發(fā)展[23]。經(jīng)典的β-catenin信號通路的活化主要表現(xiàn)為β-catenin在細胞質中增多，進一步轉移到細胞核中與T細胞因子/淋巴增強因子共同作用，啟動Wnt靶標下游基因轉錄[22]。GSK-3β能夠促進β-catenin降解。此外，在幾種不同腫瘤模型中，研究人員已經(jīng)證明β-catenin信號的激活可以通過抑制GSK-3β而激活雷帕霉素靶蛋白(MTOR)的哺乳動物靶點[24]。MTOR參與調節(jié)成年人的心臟功能，并作為調節(jié)自噬途徑的關鍵組成部分[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導14周后，糖尿病心臟中β-catenin、TCF4和MYC的mRNA和蛋白水平明顯升高，并且糖尿病增加了GSK3β和MTOR的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)提示β-catenin/TCF4/GSK-3β/MTOR信號可能參與了DCM的發(fā)展。而用GTP治療可抑制心臟中的β-catenin/TCF4/GSK-3β/MTOR信號，改善心肌細胞的自噬缺陷。

總之，本研究結果表明，GTP的施用有效改善了T1DM大鼠心臟功能、心肌肥大和間質纖維化，其作用機制可能通過抑制β-catenin/TCF4/GSK-3β/MTOR信號通路，與恢復心肌細胞中的自噬缺陷有關。