OGD動(dòng)態(tài)處理后大鼠海馬神經(jīng)元線粒體裂解及凋亡相關(guān)蛋白的變化

李學(xué)涵，劉學(xué)良，王 平，呂志宇，吳 勇，陳 秀

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000；2. 成都市新都區(qū)新都中醫(yī)醫(yī)院老年病科，四川成都 610500)

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke, AIS)引起的病理生理機(jī)制主要是缺血缺氧造成細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡或者壞死，造成不可逆性神經(jīng)細(xì)胞損害。線粒體膜通透性、線粒體形態(tài)在缺血缺氧后隨即發(fā)生變化，先于各種凋亡蛋白的產(chǎn)生，對(duì)凋亡的發(fā)生有著重要的影響，具有潛在干預(yù)前景[1]。

線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白(dynamic related protein, Drp1)，不僅是線粒體裂解始動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白，并且與缺血缺氧后細(xì)胞保護(hù)相關(guān)[2]。正常情況下，Drp1蛋白以一種磷酸化失活狀態(tài)(P-Drp1)存在于胞質(zhì)內(nèi)[3]，在缺血缺氧后迅速脫磷酸化，由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，觸發(fā)線粒體裂解進(jìn)程[4]。與此同時(shí)，Drp1調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，以實(shí)施對(duì)細(xì)胞色素 C(CytC)的釋放[5]。進(jìn)入胞質(zhì)的CytC結(jié)合凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)形成Apaf-1-CytC復(fù)合體。此復(fù)合體可激活caspase-9，活化的 caspase-9激活 caspase-3和caspase-7，從而啟動(dòng)了caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。

本研究觀察經(jīng)過不同時(shí)間的OGD處理后，大鼠海馬神經(jīng)元胞體線粒體形態(tài)改變、動(dòng)力相關(guān)蛋白變化，以及凋亡相關(guān)蛋白的變化，探討線粒體裂解對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響，以期為今后調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)態(tài)平衡關(guān)鍵靶點(diǎn)的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1一般材料細(xì)胞爬片經(jīng)消毒后，置入6孔板中，多聚賴氨酸包被細(xì)胞爬片，PBS漂洗，吹干待用。SD大鼠孕鼠(孕16～18 d)，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.177 mol/kg)，無菌條件下剖腹取胎鼠，孕鼠斷頸處死。參照文獻(xiàn)[7]對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行提取培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，滴加于細(xì)胞爬片上。

1.2方法

1.2.1 β Tublin Ⅲ蛋白行神經(jīng)元鑒定 參照文獻(xiàn)[8]對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，熒光顯微鏡觀察鑒定結(jié)果。

1.2.2 OGD處理并用共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)及藍(lán)染細(xì)胞核形態(tài)的改變 隨機(jī)將細(xì)胞分為對(duì)照組和試驗(yàn)組。對(duì)照組：直接進(jìn)行Mito Tracker染色處理。試驗(yàn)組：將細(xì)胞爬片從6孔板中撈起，浸入無糖培養(yǎng)基中[DMEM：(+)L-glutamine(-)D-glucose(-)sodium pyruvate]，將細(xì)胞置入缺氧模塊化孵化室中(modular incubator chamber, CA 92014)，充混合氣體(950 mL/L N2，50 mL/L CO2)1 min后，關(guān)閉進(jìn)、出氣口，置入孵箱中保證37 ℃環(huán)境溫度。上述處理，每次置入3個(gè)細(xì)胞爬片，共處理4次，處理時(shí)間分別是30、45、60、90 min。后續(xù)處理同對(duì)照組。并用共聚焦顯微鏡觀察對(duì)照組及試驗(yàn)組線粒體形態(tài)及藍(lán)細(xì)胞核形態(tài)的改變。

1.2.3 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位(△Ψm) 50 μL JC-1(200×)加入8 mL超純水比例稀釋，混勻，加入2 mL JC-1染色緩沖液(5×)，即為JC-1工作液。按照1.2.2項(xiàng)方法OGD處理對(duì)照組、試驗(yàn)組后，將6孔板內(nèi)液體更換為JC-1工作液，每孔1 mL，室溫下孵育20 min。觀察前用PBS漂洗1遍，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Western blot檢測(cè)P-Drp1、caspase 3的表達(dá) 提取對(duì)照組、試驗(yàn)組總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配平蛋白濃度；制膠，上樣蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵一抗，漂洗，孵二抗，漂洗。同時(shí)測(cè)定內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)。曝光成像。運(yùn)用凝膠定量軟件Image J分析灰度值。

1.2.5 提取胞質(zhì)中CytC，并用Western blot檢測(cè)其表達(dá) 同上設(shè)置對(duì)照組、試驗(yàn)組，使用線粒體提取試劑盒將每一組細(xì)胞中的線粒體去除，然后提取剩余胞質(zhì)中總蛋白，并用Western blot檢測(cè)胞質(zhì)中CytC的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果神經(jīng)元形態(tài)(圖1)：β Tublin Ⅲ蛋白染色后，在熒光顯微鏡觀察下，神經(jīng)元整個(gè)顯示綠色熒光。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)及藍(lán)色細(xì)胞核形態(tài)的改變線粒體形態(tài)結(jié)果顯示，海馬神經(jīng)元線粒體在OGD處理30 min時(shí)已發(fā)生裂解，并隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，線粒體裂解成更小形態(tài)的線粒體，裂解線粒體的數(shù)量增加(圖2)；根據(jù)文獻(xiàn)，將線粒體分為管狀、棒狀以及球狀，分別代表正常線粒體、線粒體腫脹以及裂解[11]，3種形態(tài)線粒體在各實(shí)驗(yàn)組中所占比例見表1。

表13種形態(tài)線粒體在各組間所占比例以及裂解率

Tab.1 The proportion and cleavage rate of three types of mitochondria in each group

(%)

總體趨勢(shì)χ2=73.77，n=4，P<0.05。

圖1熒光顯微鏡下觀察大鼠海馬神經(jīng)元

Fig.1 Rat hippocampal neurons observed under fluorescence microscope

A：DAPI染色細(xì)胞核；B：β Tublin Ⅲ染色神經(jīng)元微管；C：merged。

圖2激光共聚焦顯微鏡觀察的線粒體裂解情況

Fig.2 Mitochondrial cleavage observed by laser confocal microscopy

A：0 min；B：30 min；C：45 min；D：60 min；E：90 min。

2.3熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的改變熒光顯微鏡下觀察可見(圖3)：空白對(duì)照組，全部線粒體呈現(xiàn)高亮橙色，未見綠色熒光，表明線粒體膜電位正常；30 min組，神經(jīng)元胞體線粒體呈現(xiàn)中亮綠色熒光，軸突大部分線粒體呈現(xiàn)高亮橙色熒光；45 min組，神經(jīng)元胞體線粒體呈現(xiàn)稍高亮綠色熒光，軸突大部分線粒體呈現(xiàn)中亮橙色熒光；60 min組，神經(jīng)元胞體呈現(xiàn)亮綠色熒光，軸突部分線粒體呈現(xiàn)中亮橙色熒光；90 min組，神經(jīng)元胞體以及軸突大部分呈現(xiàn)高亮綠色熒光，軸突少部分呈現(xiàn)微弱橙色熒光；CCCP組(線粒體膜電位完全崩解，作為本次試驗(yàn)的陰性對(duì)照)，全部線粒體出現(xiàn)綠色熒光，膜電位喪失。

圖3熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的改變

Fig.3 The change of mitochondrial transmembrane potential observed by fluorescence microscopy

A：對(duì)照組；B：30 min；C：45 min；D：60 min；E：90 min；F：CCCP組。

2.4P-Drp1蛋白在各組的表達(dá)情況P-Drp1的表達(dá)結(jié)果(圖4)：0 min組P-Drp1高表達(dá)，30 min組P-Drp1蛋白表達(dá)下降，并伴隨著OGD處理時(shí)間延長(zhǎng)P-Drp1表達(dá)進(jìn)一步降低(圖4A)；與對(duì)照組相比，30、45、60、90 min P-Drp1蛋白表達(dá)逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

圖4各組細(xì)胞中P-Drp1蛋白表達(dá)情況

Fig.4 The expression of P-Drp1 protein in cells of each group

A：Western blot蛋白條帶；B：P-Drp1蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

2.5CytC在對(duì)照組、試驗(yàn)組胞質(zhì)中的表達(dá)情況圖5A顯示：在0 min組、30 min組及45 min組胞質(zhì)中CytC含量極低，但在60 min、90 min組胞質(zhì)中可見CytC高表達(dá)。圖5B顯示：與0 min組相比，30 min組、45 min組CytC蛋白的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)；與0 min組相比，60 min組及90 min組CytC蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6Western-blot檢測(cè)細(xì)胞中caspase3的表達(dá)0 min、30 min、45 min可見caspase 3 低表達(dá)，60 min、90 min可見caspase 3高表達(dá)(圖6A)；與0 min組相比，30 min 組、45 min組 caspase 3蛋白的表達(dá)無明顯增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與0 min組相比，60 min組 、90 min組 caspase 3蛋白的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6B)。

2.7組間蛋白灰度值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組P-Drp1蛋白表達(dá)逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)比較，30 min組與45 min組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對(duì)照組相比，60 min組與90 min組CytC蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)比較，0 min與30 min組，30 min組與45 min組，45 min組與60 min組，60 min組與90 min組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，60 min組與90 min組caspase 3蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組內(nèi)比較，0 min組與45 min組，60 min組與90 min組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

圖5各分組胞質(zhì)中CytC的表達(dá)

Fig.5 The expression of CytC in cytoplasm of cells in each group

A：Western blot蛋白條帶；B：CytC蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

圖6各分組中caspase3的表達(dá)

Fig.6 The expression of caspase 3 in cytoplasm of cells in each group

A：Western blot蛋白條帶；B：caspase 3蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

表2各組P-Drp1、CytC、caspase3相對(duì)灰度值的比較

Tab.2 Relative gray value of P-Drp1, CytC, and caspase 3 in different groups

分組P-Drp1CytCcaspase 3對(duì)照組102.058±14.99740.059±12.31538.402±9.175 30min組84.315±8.543? 55.882±16.74345.029±11.11045min組80.419±9.911?62.998±15.133 43.436±9.30760min組51.848±20.802? 108.138±15.005?89.445±5.846?90min組32.920±10.363? 110.401±26.379? 90.231±5.869?

與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

既往試驗(yàn)中，正常生理?xiàng)l件下，線粒體處于不斷融合與裂解的動(dòng)態(tài)平衡中，將線粒體裂解程度從完全裂解至無裂解分為1～5級(jí)，那么正常線粒體動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)處于3～4級(jí)，與本試驗(yàn)結(jié)果相符合[9]。

正常線粒體膜電位與線粒體內(nèi)膜高度不通透性是線粒體保持正常生理功能的前提，線粒體膜電位改變是反映線粒體通透性改變的最佳指標(biāo)之一[4]。線粒體膜通透性增加達(dá)到某閾值后，線粒體內(nèi)外兩層膜之間的CytC隨著線粒體裂解，游逸到胞質(zhì)內(nèi)，觸發(fā)caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。本次試驗(yàn)通過檢測(cè)線粒體膜電位改變以及CytC表達(dá)，從而反映線粒體膜滲透性的改變。圖2、表2顯示，線粒體膜電位在OGD處理30min時(shí)已下降，并隨著OGD處理時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)一步下降；膜通透性隨著OGD處理而增加，且隨著OGD處理時(shí)間延長(zhǎng)通透性進(jìn)一步增加，并且在60 min后引起CytC釋放入胞質(zhì)。

在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，CytC觸發(fā)激活caspase 9，進(jìn)而激活caspase 3，進(jìn)而進(jìn)展到不可逆性凋亡階段；根據(jù)文獻(xiàn)，神經(jīng)元凋亡相關(guān)指標(biāo)在OGD后1 h出現(xiàn)明顯變化，引起輕微的細(xì)胞損傷[11-12]，與本次試驗(yàn)結(jié)果相符。

2016年，RITA等[13]在實(shí)驗(yàn)中揭示了在45 min OGD過程中，線粒體裂解增強(qiáng)但是不伴凋亡的發(fā)生；此時(shí)立即復(fù)氧，線粒體暫時(shí)性回歸裂解前狀態(tài)。該研究OGD過程結(jié)果與本次試驗(yàn)相符合，均在OGD后立即發(fā)現(xiàn)線粒體裂解但不伴凋亡的發(fā)生。在本次試驗(yàn)中，我們持續(xù)予以O(shè)GD以尋求線粒體裂解直至發(fā)生凋亡的時(shí)間點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)線粒體在OGD 60 min內(nèi)裂解均不伴凋亡的發(fā)生。但是JC-1顯示，在此時(shí)期線粒體膜電位持續(xù)性下降。在上述討論中已經(jīng)提到，當(dāng)線粒體膜通透性增加至CytC可以通過時(shí)，CytC釋放入細(xì)胞質(zhì)中，觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可能在OGD 60 min內(nèi)線粒體膜通透性尚不允許CytC通過。

在神經(jīng)細(xì)胞中，線粒體自噬屬于日常行為，此時(shí)損傷線粒體膜電位下降作為自噬位點(diǎn)標(biāo)志，吸引相關(guān)蛋白聚集于此介導(dǎo)自噬[14-15]。MADINENI[16]在2016年一項(xiàng)研究中提及，在缺血缺氧早期階段，Drp1依賴線粒體自噬途徑即被觸發(fā)，并且作為一種細(xì)胞保護(hù)作用，抑制后將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在OGD后30 min即有線粒體裂解，此時(shí)線粒體膜電位下降亦屬于始發(fā)階段，線粒體膜電位部分下降是否同時(shí)引起線粒體自噬而顯示出線粒體裂解增加還需進(jìn)一步研究?？梢源_定的是，線粒體裂解在OGD持續(xù)后呈現(xiàn)出一個(gè)連續(xù)的過程，即便此時(shí)線粒體裂解的意義已經(jīng)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)換，但是僅從線粒體裂解過程中并不能得到體現(xiàn)，因?yàn)槠浔憩F(xiàn)形式總是裂解增加，但是線粒體膜電位下降程度或許可以部分指示線粒體可能出現(xiàn)的裂解意義。在60 min組，線粒體膜電位下降程度標(biāo)志線粒體已經(jīng)成為了細(xì)胞凋亡促進(jìn)者。

文獻(xiàn)表明，提高Drp1蛋白表達(dá)，可增加神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受，減少受損面積[17]。究其原因，在缺血缺氧后早期神經(jīng)細(xì)胞主要發(fā)生自噬機(jī)制，作為一種細(xì)胞保護(hù)作用，此時(shí)抑制Drp1則造成損傷[18]。但是，在缺血缺氧后期，線粒體膜通透性不可避免增加，而Drp1蛋白最終也將淪為神經(jīng)元凋亡的促進(jìn)因素。那么，要獲得提高Drp1蛋白帶來的細(xì)胞保護(hù)作用，在OGD條件下，這個(gè)時(shí)間范圍為60 min。