脂聯(lián)素基因rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性與血壓對(duì)鈉、鉀反應(yīng)性的相關(guān)性研究

吳冠吉，牟建軍，劉富強(qiáng)，蔣 偉，張 敏

(1. 西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710003；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061)

脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是白色脂肪組織分泌的一種激素蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與體脂含量呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞因子。研究表明，APN具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性等廣泛的生物學(xué)活性[1-3]。新近的臨床研究提示，低APN水平是高血壓發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，且這種作用獨(dú)立于胰島素抵抗和糖尿病之外[4]。血漿APN水平在原發(fā)性高血壓組明顯低于血壓正常對(duì)照組，并且與收縮壓、舒張壓呈顯著負(fù)相關(guān)[5-6]。APN基因多態(tài)性45T/G、276G/T、I164/T與高血壓的相關(guān)性研究在國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，日本人群中APN I164/T突變的個(gè)體中攜帶TC基因型的個(gè)體表現(xiàn)出較低的血漿APN濃度，并且大多數(shù)C等位基因攜帶者患有高血壓[7]。對(duì)中國(guó)香港人群研究發(fā)現(xiàn)，APN單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)rs266729(-11377C/G)與原發(fā)性高血壓具有明顯相關(guān)性[8]。然而到目前為止，有關(guān)APN基因多態(tài)性與血壓鹽敏感性關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀干預(yù)試驗(yàn)，觀察高鹽攝入以及補(bǔ)鉀對(duì)血壓正常個(gè)體的血壓、血漿APN水平的影響，并進(jìn)一步研究APN基因rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性與血壓對(duì)鈉、鉀反應(yīng)性的關(guān)系，探討APN及在鹽敏感性高血壓形成中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象陜西眉縣農(nóng)村漢族人群中，選擇年齡18～60歲，收縮壓130～160 mmHg、舒張壓85～100 mmHg，性別不限并且未服用降壓藥物治療的自愿者作為先證者，先證者及其同胞、配偶及子女參與慢性鹽負(fù)荷飲食干預(yù)試驗(yàn)，所有參與者均簽署知情同意書。共入選342例，年齡(40.3±9.1)歲，其中男性182例，女性160例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心血管疾病和肝臟、腎臟、糖尿病等急慢性疾?。虎谘装Y感染性疾?。虎塾绊懷獕夯螂娊赓|(zhì)代謝的內(nèi)分泌疾??；④孕婦，經(jīng)常飲酒、吸煙者；⑤不愿在知情同意書上簽字以及不能夠堅(jiān)持完成試驗(yàn)者。

1.2方法

1.2.1 基線資料調(diào)查和飲食干預(yù) 連續(xù)3 d基線資料調(diào)查，包括病史詢問(wèn)，測(cè)量體質(zhì)量、身高、腰圍、臀圍、血壓，采集1次空腹靜脈血樣，收集1次24 h尿、2次夜尿后進(jìn)行為期3周的慢性鹽負(fù)荷及補(bǔ)鉀飲食干預(yù)。采取統(tǒng)一管理、集體配餐的方式，分3個(gè)階段進(jìn)行：①低鹽階段(鹽3 g/d)，相當(dāng)于(鈉51.3 mmol/d)干預(yù)1周；②高鹽階段(鹽18 g/d)，相當(dāng)于(鈉307.8 mmol/d)干預(yù)1周；③高鹽補(bǔ)鉀階段(鉀60 mmol/d和鈉307.8 mmol/d)，干預(yù)1周。為確保攝鹽量精確，現(xiàn)場(chǎng)配備專業(yè)廚師，加工的食物本身不含鹽和任何含鹽制品，就餐時(shí)由營(yíng)養(yǎng)監(jiān)督員負(fù)責(zé)將定量的鹽包撒入食物中，并監(jiān)督受試對(duì)象將食物吃完。

1.2.2 血壓測(cè)量 在基線調(diào)查和每個(gè)干預(yù)階段的第2、5、6、7天測(cè)量血壓，受試者靜坐休息5 min后采用英國(guó)產(chǎn)隨機(jī)零點(diǎn)血壓計(jì)測(cè)量。按照Korotkoff 聽(tīng)音法量3次血壓，每次測(cè)量間隔30 s，求其平均值。參與血壓測(cè)量的工作人員均經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)并通過(guò)合格認(rèn)證考試。參考國(guó)外慢性鹽負(fù)荷試驗(yàn)中鹽敏感性(salt sensitivity, SS)判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：于高鹽(high-sodium, HS)飲食末平均動(dòng)脈壓(MAP)較低鹽(low-sodium, LS)飲食期MAP升高幅度≥10%者為鹽敏感者(SS)，<10%則為鹽不敏感者(NSS)。MAP=舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓)。

1.2.3 血、尿標(biāo)本的收集 每個(gè)干預(yù)階段的第5、6、7天，收集3次尿標(biāo)本(1次24 h尿，2次夜尿)，各干預(yù)階段的第6天留取血標(biāo)本。血標(biāo)本采集：清晨空腹靜脈采血，每次采血量為2管(4 mL非抗凝和4 mL EDTA抗凝)，2 600 r/min離心15 min，分離血清、血漿標(biāo)本于-80 ℃冷凍保存待測(cè)。尿標(biāo)本收集：分發(fā)給參加者24 h或夜尿收集說(shuō)明和收集容器，使用量筒測(cè)量體積，吸取5 mL的尿標(biāo)本分別轉(zhuǎn)移至每個(gè)尿貯存管置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。如24 h尿總量小于500 mL，或者收集時(shí)間小于22 h，或者總尿肌酐小于7 mg/kg被認(rèn)為24 h尿收集不全，棄用，重新留取。

1.2.4 APN基因分型 采用ReadyAmpTM基因組DNA純化系統(tǒng)(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)純化外周血DNA。運(yùn)用連接酶特異檢測(cè)技術(shù)(LDR-PCR)對(duì)APNrs266729位點(diǎn)進(jìn)行基因分型：PCR引物、探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Taq酶、DNTP為Fermentas(MBI)公司產(chǎn)品，TaqDNA ligase由NEB(www.neb-china.com/)公司提供，PCR儀為ABI 9700(上海奧然科貿(mào)有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1受試者的一般特征和飲食干預(yù)后的血壓變化共納入受試者342例(表1)。其中檢出SS 130例(男性66例，女性64例)，NSS 212例(男性116例，女性96例)，鹽敏感檢出率為38%。先證者基線期收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓水平高于同胞、配偶及子女，父母基線期收縮壓水平最高；飲食干預(yù)后血壓在低鹽期下降，高鹽期升高，高鹽補(bǔ)鉀期再次下降(表2)。

表1受試者的一般特征

Tab.1 General characteristics of the participants

組別例數(shù)年齡(歲)男性(%)BMI(kg/m2)先證者10240.5±7.669.623.0±2.8同胞17239.4±7.350.022.3±2.9配偶1947.4±6.122.222.5±3.2子女4923.3±7.146.819.9±2.5父母18666.1±8.247.820.4±2.6

BMI：體質(zhì)量指數(shù)。

表2飲食干預(yù)后的血壓變化

Tab.2 BP responses to dietary intervention

組別血壓基線期低鹽期高鹽期高鹽補(bǔ)鉀期先證者SBP140.6±11.0131.5±10.0?138.4±10.4#131.8±8.6△DBP90.8±7.984.9±9.3?88.3±8.1#85.1±7.7△MAP107.4±8.2100.4±9.0?104.9±8.5#100.6±7.4△同胞SBP127.4±10.5123.6±9.1?128.5±11.1#123.2±8.9△DBP70.0±8.266.4±7.7?68.6±9.366.1±7.9MAP89.1±8.585.4±7.6?88.5±9.5#85.0±7.8△配偶SBP128.6±12.2122.5±7.7? 128.4±10.9#122.8±9.4△DBP70.6±6.967.1±5.8?68.6±7.565.9±7.1MAP89.9±7.985.6±5.4?88.5±7.584.8±7.1△子女SBP102.4±10.799.9±9.4 101.7±10.0100.4±9.6DBP62.9±8.760.2±8.360.4±8.359.5±8.0MAP76.1±9.073.5±8.374.3±8.473.2±8.1父母SBP143.6±21.6---DBP90.7±10.8---MAP108.3±13.4---

SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；MAP：平均動(dòng)脈壓。與基線期比較，*P<0.05；與低鹽期比較，#P<0.05；與高鹽期比較，△P<0.05。

2.2受試者各階段24h尿鈉、鉀變化與基線期比較，尿鈉排泄量在低鹽期明顯下降，在高鹽期明顯升高；此外，補(bǔ)鉀不僅能夠增加鉀的排泄量，而且能輕微促進(jìn)鈉的排泄(表3)。

2.3Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)的CC、CG和GG基因型頻率分別為50%、43.58%和6.42%，C和G等位基因的頻率分別為71.8%和28.2%。通過(guò)Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，χ2=3.67，P>0.05，說(shuō)明該基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，提示該樣本來(lái)自一遺傳平衡的總體。

2.4脂聯(lián)素rs266729基因多態(tài)性與血壓鈉、鉀反應(yīng)性的相關(guān)性經(jīng)單個(gè)位點(diǎn)家系關(guān)聯(lián)性分析(single-marker FBAT analysis)結(jié)果顯示：rs266729(-11377C/G)C等位基因單位點(diǎn)多態(tài)性與鹽敏感性的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.320，P=0.020)；C等位基因單位點(diǎn)多態(tài)性與血壓鉀反應(yīng)性的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.325，P=0.020，表4)。

表3受試者干預(yù)各期24h尿鈉、鉀排泄量的變化

Tab.3 Effects of the dietary intervention on 24 h urinary sodium and potassium excretions

組別24h尿鈉/鉀排泄量(mmol)基線期 低鹽期 高鹽期 高鹽補(bǔ)鉀期 先證者鈉228.0±11.654.9±6.8?317.0±21.8?#329.0±24.2?#鉀36.8±6.831.4±8.933.4±7.896.8±9.6?#△同胞鈉213.0±16.453.6±5.4?324.0±28.6?#331.0±25.9?#鉀41.1±9.139.8±7.636.6±9.189.3±11.5?#△配偶鈉218.0±20.852.8±6.7?328.0±20.5?#324.0±28.4?#鉀39.4±12.334.2±6.732.2±8.294.6±8.6?#△子女鈉115.0±23.458.2±7.4?319.0±25.1?#327.0±21.8?#鉀45.6±18.740.5±9.739.8±9.298.7±10.7?#△

與基線期比較，*P<0.01；與低鹽期比較，#P<0.01；與高鹽期比較，△P<0.01。

表4脂聯(lián)素rs266729基因多態(tài)性與血壓及其鹽敏感性的關(guān)聯(lián)性分析

Tab.4 Association between SNP rs266729 polymorphism and salt sensitivity

變量等位基因等位基因頻率fam#S-E(S)Var(S)ZP值SBPC0.71855-85.1876084.091-1.0920.274G0.2825585.1876084.0911.0920.274DBPC0.71811-36.040675.236-1.3870.165G0.2824931.4332576.9840.6190.535MAPC0.71855-73.3773767.366-1.1950.231G0.2825573.3773767.3661.1950.231SS-10C0.71830 12.41828.642 2.3200.020G0.28230-12.41828.642-2.3200.020SK-10C0.71819 11.62624.996 2.3250.020G0.28219-11.62624.996-2.3250.020

SBP：收縮壓；DBP舒張壓；MAP平均動(dòng)脈壓；SS-10：血壓鈉反應(yīng)性，鹽敏感組MAP(HS)-MAP(LS)≥10%；SK-10：血壓鉀反應(yīng)性，鹽敏感組補(bǔ)鉀MAP下降≥10%；fam#：等位基因關(guān)聯(lián)性分析中參與分析的能夠提供信息的家系數(shù)目，當(dāng)參與分析的有效家系數(shù)不足10家，將不計(jì)算統(tǒng)計(jì)量；S：在無(wú)效假設(shè)成立情況下檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量；E(S)和Var(S)：檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的預(yù)測(cè)值和方差；Z：對(duì)E(S)和Var(S)標(biāo)準(zhǔn)化正態(tài)轉(zhuǎn)換后所獲得的S值，只有當(dāng)Z值為正且P<0.05時(shí)才表示該基因型與變量間有遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)。

3 討 論

1995年，SCHERER等[10]首次從幼鼠脂肪細(xì)胞中克隆出APN cDNA，并將APN稱Acrp30，后又稱AdipoQ，GBP28，apM1。APN基因的mRNA，是脂肪組織中含量最豐富的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，具有脂肪組織特異性，故又稱為APN基因(apM1)。全基因掃描顯示apM1位于3q27區(qū)域，全長(zhǎng)17 kb，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。文獻(xiàn)報(bào)道apM1的3q27區(qū)域是2型糖尿病和代謝綜合征的易感位點(diǎn)[11]。

越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，APN基因多態(tài)性在高血壓的發(fā)病機(jī)制中也可能起到重要的作用。目前關(guān)于APN基因多態(tài)性與高血壓的相關(guān)性研究主要集中在45T/G、276G/T、I164/T等多態(tài)性上。IWASHIMA等[7]對(duì)先前已經(jīng)在日本人群中報(bào)道的與APN濃度有關(guān)的兩個(gè)基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，I164/T突變的個(gè)體中攜帶TC基因型的個(gè)體表現(xiàn)出較低的血漿APN濃度，并且大多數(shù)C等位基因攜帶者患有高血壓。此外，TC基因型與高血壓之間具有強(qiáng)的相關(guān)性。相比之下，G276T基因突變未發(fā)現(xiàn)與APN濃度或高血壓之間有明顯的相關(guān)性。WU等[12]對(duì)12項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析結(jié)果表明，盡管APN 45T/G、276G/T多態(tài)性與高血壓無(wú)明顯相關(guān)性，但276G/T雜合突變?cè)黾友h(huán)中APN水平并且升高血壓，尤其在高血壓患者中。賈玫等[13]應(yīng)用變性高效液相色譜分析法研究顯示，APN基因啟動(dòng)子區(qū)rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓具有相關(guān)性，并且G等位基因與收縮壓、體質(zhì)量指數(shù)、腰臀比呈正相關(guān)，提示基因rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性可能增加原發(fā)性高血壓的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。ONG等[8]研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)香港人群中，rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓具有明顯相關(guān)性，且這種相關(guān)性不受性別影響。

新近的人群及動(dòng)物研究表明，鹽攝入可調(diào)節(jié)APN水平。LELY等[14]對(duì)35例健康男性進(jìn)行為期7 d的低鹽飲食干預(yù)，發(fā)現(xiàn)血漿APN水平明顯下降。KAMARI等[5]在SD大鼠中發(fā)現(xiàn)，高鹽攝入增加血漿APN水平，并獨(dú)立于血壓之外。認(rèn)為鹽負(fù)荷可能誘導(dǎo)體內(nèi)炎癥狀態(tài)，從而升高APN水平。本課題組之前對(duì)鹽敏感者的干預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血壓正常的鹽敏感者在攝入高鹽后，可導(dǎo)致血壓升高，但血漿APN的濃度無(wú)明顯變化，而鹽不敏感組血漿APN的濃度明顯升高。提示兩組受試者血漿APN濃度對(duì)高鹽刺激后的反應(yīng)存在差異，說(shuō)明APN產(chǎn)生可能是對(duì)鹽負(fù)荷的一種保護(hù)性反應(yīng)。與鹽不敏感者相比，即使血壓正常的鹽敏感者在高鹽飲食下，也存在與鹽負(fù)荷相關(guān)的血漿APN水平下降，且這種變化參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，APN基因啟動(dòng)子區(qū)rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性與血壓的鈉、鉀反應(yīng)性均具有明顯相關(guān)性。提示APN基因啟動(dòng)子區(qū)rs266729(-11377C/G)位點(diǎn)多態(tài)性也可能是血壓鹽敏感性的一個(gè)易感基因。這可能是血壓正常的鹽敏感者高鹽負(fù)荷下APN增高反應(yīng)不足，鹽敏感性高血壓患者血漿APN水平明顯降低的重要原因。

不同種族、不同地域的人群攜帶基因可能存在數(shù)量和性狀的差異，ZHAO等[17]對(duì)35項(xiàng)研究進(jìn)行的薈萃分析結(jié)果顯示，APN基因啟動(dòng)子區(qū)rs266729(-11377C/G)多態(tài)性與血壓無(wú)明顯相關(guān)性，上述結(jié)果的不一致可能歸因于民族習(xí)慣、環(huán)境因素和研究方法的差異。本研究中APN基因多態(tài)性的研究對(duì)象為陜西關(guān)中地區(qū)漢族人群，為小樣本研究，缺乏一定的代表性。關(guān)于APN基因變異與血壓鹽敏感性之間的關(guān)系還有待于更大樣本量及分子遺傳學(xué)方面的研究。