組蛋白甲基化抑制劑UNC0638對水牛轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因表達的影響

劉曉華，文冬梅，余 慶，鄧 凱，陸鳳花，石德順

(廣西大學(xué)，亞熱帶資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

轉(zhuǎn)基因動物在定向育種、生物反應(yīng)器、疾病模型、器官移植、功能基因組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。如何提高轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)效率，定點整合外源基因及維持外源基因高豐度表達[1]是轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域面臨的主要問題。整合有外源基因的細(xì)胞其基因表達水平會伴隨著傳代次數(shù)的增加被抑制[2-4]，表觀遺傳修飾的動態(tài)變化可能是影響基因表達的主要因素。

組蛋白修飾作為表觀遺傳中重要的調(diào)控機制之一,在包括基因表達調(diào)控等多種生物學(xué)過程中起著重要作用。哺乳動物中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EHMT2被認(rèn)為是常染色質(zhì)區(qū)催化組蛋白H3K9二甲基化(H3K9me2)，并調(diào)節(jié)該區(qū)域基因表達的主要酶[5]。H3K9me2是基因轉(zhuǎn)錄抑制及異染色質(zhì)形成的主要原因[6]，異染色質(zhì)作為染色體的組成部分，在細(xì)胞周期中保持濃縮狀態(tài)，具有重要的生物學(xué)功能?？寺∨咛ブ挟惓５慕M蛋白H3K9me2導(dǎo)致多能性基因Oct4無法正常表達[7]，高豐度的組蛋白H3K9甲基化水平是阻礙細(xì)胞獲得全能性的主要因素[8]。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶EHMT2特異性抑制劑BIX01294[9]成功應(yīng)用于多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)及克隆胚胎發(fā)育率的提高[10-11]，但由于較高的細(xì)胞毒性在綿羊與小鼠克隆胚胎的應(yīng)用中并未獲益[12-13]。Vedadi等[14]報道的小分子抑制劑UNC0638可高效特異性的結(jié)合組蛋白H3K9me2甲基化轉(zhuǎn)移酶EHMT2與EHMT1，并具較低的細(xì)胞毒性。供體細(xì)胞經(jīng)UNC0638處理后，可顯著降低克隆胚胎H3K9me2水平，并影響克隆胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因Nanog與Oct4的表達[15]。

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在體外培養(yǎng)、胚胎發(fā)育過程及轉(zhuǎn)基因動物個體中普遍存在外源基因沉默現(xiàn)象[16]。UNC0638作為一種組蛋白修飾小分子藥物能否通過調(diào)節(jié)H3K9me2甲基化水平，進而促進外源基因表達，仍未見相關(guān)的報道。因此，初步探討UNC0638對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因表達的影響，有助于人們進一步了解外源基因整合后的表達機制，并為轉(zhuǎn)基因水牛生產(chǎn)效率的提高提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 水牛胎兒成纖維細(xì)胞(BFFs)與以綠色熒光蛋白(eGFP)基因為報告基因的轉(zhuǎn)PRL基因水牛胎兒成纖維細(xì)胞系由廣西亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室培養(yǎng)保存。

1.1.2 試劑 本試驗所用試劑除特別注明外，其它試劑均來自美國Sigma公司；UNC0638購自Cayman公司，組蛋白H3K9me2甲基化抗體購自Abcam公司。胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；無Ca2+、Mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.25%胰酶(trypsin)，細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS；一抗：Anti-Histone H3 (di methyl K9) 的鼠源單克隆抗體(1∶100)；二抗：FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG (1∶200)；UNC0638液: DMSO預(yù)溶，以DMEM液配制50 μmol·L-1母液，根據(jù)試驗要求用DMEM液稀釋成不同濃度的工作液，在工作液中，DMSO的濃度要控制在0.1%以內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 BFFs傳代培養(yǎng)及生長曲線繪制 BFFs復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，分別用添加有不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638的DMEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度約為(2～3)×104·mL-1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔500 μL，置于38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。每隔24 h消化細(xì)胞，每個培養(yǎng)濃度消化，分別收集3個孔的細(xì)胞，連續(xù)8 d，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，每孔記數(shù)3次，取其平均值進行生長曲線的繪制。

1.2.2 BFFs染色體核型分析 UNC0638處理第7代BFFs 48 h后，使用濃度為0.1～0.2 μg·mL-1秋水仙素繼續(xù)培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞。加入預(yù)熱至37 ℃的0.075 mol·L-1KCl低滲處理，加入2 mL新鮮配制且預(yù)冷的甲醇-冰乙酸(3∶1)固定液，固定細(xì)胞1～2 min，離心棄上清。加5 mL新鮮配置的甲醇-冰乙酸(3∶1)固定液，使用槍頭吹出來的氣泡輕輕吹打細(xì)胞，重懸細(xì)胞，室溫條件下固定30 min。離心棄上清后，加入200 μL固定液，輕輕吹打混勻細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液，在距離20 cm以上的高度滴1～2滴細(xì)胞懸液于-20 ℃預(yù)冷的載玻片上，固定細(xì)胞。用Giemsa染液染色15～20 min，清水沖洗后晾干。在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色體數(shù)目，對典型的中期染色體拍照，隨機抽取統(tǒng)計染色體數(shù)目。

1.2.3 免疫熒光檢測BFFs組蛋白H3K9me2甲基化水平 BFFs分別經(jīng)不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理48 h后，取出爬片上的細(xì)胞玻片，放入12孔板內(nèi)，PBS清洗兩次后，室溫下用4%多聚甲醛固定40 min。阻斷液(含有100 mmol·L-1的甘氨酸和0.3% BSA的PBS緩沖液)沖洗3次，每次5 min，用1% Tritonx-100室溫透化25 min，阻斷液沖洗3次，每次5 min。1% BSA室溫封閉1 h，Triton-BSA-PBS洗3次后加入100 mL一抗，4 ℃過夜孵育，次日37 ℃生化培養(yǎng)箱孵育30 min，Triton-BSA-PBS洗3次。二抗室溫避光孵育1.5 h，Triton-BSA-PBS沖洗3次。10 μg·mL-1碘化丙啶(PI)室溫避光染核10 min，Triton-BSA-PBS沖洗3次，凡士林壓片，使用激光共聚焦掃描拍照。

1.2.4 BFFs細(xì)胞RNA提取 使用不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理水牛轉(zhuǎn)基因BFFs(24、48 h)后， Trizol法提取RNA，分光光度計及電泳檢測其純度和完整性，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照一步快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物公司)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:2 μg總RNA，5×TransScript All- in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water補足20 μL，輕輕混勻后，42 ℃孵育15 min，85 ℃滅活5 min，4 ℃終止。

1.2.5 qRT-PCR檢測 qRT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL：RT-PCR產(chǎn)物1 μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μL，Primer F/R (10 μmol·L- 1) 0.6 μL，RNase Free water 8.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ (或者58 ℃) 1 min，40個循環(huán)，試驗對每個樣品進行3次重復(fù)。β-actin作內(nèi)參對其進行標(biāo)準(zhǔn)化，運用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量，組間差異利用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。引物信息見表1。

表1用于PCR反應(yīng)各個基因引物序列和反應(yīng)條件

Table1DetailsofprimersusedforPCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence退火溫度/℃Tm長度/bpLengthβ-actinF:ACCGCAAATGCTTCTAGG58199R:ATCCAACCGACTGCTGTCeGFPF:ACGGCATCAAGGTGAACT60201R:GTGTTCTGCTGGTAGTGGTC

1.3 數(shù)據(jù)分析

免疫熒光強度相對水平的分析和基因相對表達量的分析均采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。每個試驗重復(fù)至少3次，染色體核型分析采用卡方檢驗，P>0.05表示差異不顯著；P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度UNC0638對BFFs增殖的影響

不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理BFFs 8 d。結(jié)果如圖1所示，UNC0638處理組與對照組相比，生長曲線趨勢大致相同，均呈“S”形分布。0.5、1.5、2.5 μmol·L-1處理組與對照組相比細(xì)胞增殖效率沒有顯著變化，5.0 μmol·L-1處理組細(xì)胞生長受到抑制，3 d后開始增殖，與其他各組相比細(xì)胞增殖效率下降。

2.2 不同濃度UNC0638對BFFs核型的影響

BFFs正常數(shù)目染色體如圖2 a所示，異常染色體數(shù)如圖2 b所示。結(jié)果顯示BFFs經(jīng)不同濃度(0.0、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理48 h后對其細(xì)胞核型無顯著影響(表2)。

圖1 不同UNC0638濃度對BFFs生長曲線的影響Fig.1 Growth curves of BFFs cultured in different concentration of UNC0638

a.正常染色體數(shù)(46,XX)；b. 異常染色體數(shù)a.Normal chromosome No.; b.Abnormal chromosome No.圖2 BFFs染色體中期分裂相Fig.2 The metaphase spreads of chromosome of BFFs

表2不同濃度UNC0638處理BFFs后的核型分析

Table2KaryotypeanalysisofBFFsindifferentconcentrationofUNC0638

UNC0638濃度/(μmol·L-1)Concentration of UNC0638總數(shù)(n)Total非整二倍體數(shù)(≠2n)Non-diploid No.正常率/%Normal rate0.021290.470.524387.501.520385.002.521385.71

2.3 不同濃度UNC0638對BFFs組蛋白H3K9me2甲基化狀態(tài)的影響

BFFs分別經(jīng)不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5、5.0 μmol·L-1)UNC0638處理48 h，檢測各組細(xì)胞組蛋白H3K9me2甲基化水平(圖3a),并統(tǒng)計熒光強度，結(jié)果如圖3b所示：各處理組與對照組相比組蛋白H3K9me2甲基化水平顯著降低(P<0.05)，其中0.5、1.5、2.5 μmol·L-1組間不存在顯著差異(P>0.05)，5.0 μmol·L-1組顯著低于0.5 μmol·L-1組(P<0.05)，但與1.5、2.5 μmol·L-1組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同濃度UNC0638對轉(zhuǎn)基因BFFs eGFP基因表達的影響

不同濃度(0.0(對照組)、0.5、1.5、2.5 μmol·L-1)UNC0638處理轉(zhuǎn)基因BFFs(24、48 h)后，結(jié)果如圖4所示：處理24 h，僅2.5 μmol·L-1處理組eGFP的表達顯著高于對照組(P<0.05)；處理48 h，各處理組與對照組相比eGFP的表達水平顯著提高(P<0.05)。

3 討 論

轉(zhuǎn)基因動物研究始于20世紀(jì)70年代末，是生物技術(shù)領(lǐng)域研究熱點之一，該技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景及重要的經(jīng)濟價值。然而轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)過程中外源基因?qū)肴悦媾R著效率低及無法精確控制基因表達等問題。有報道指出一些與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)的表觀遺傳小分子抑制劑可提高外源基因在體內(nèi)外的表達水平[17]。本研究探討組蛋白甲基化小分子抑制劑UNC0638處理水牛轉(zhuǎn)基因BFFs后對外源基因表達效率的影響。

a.BFFs組蛋白H3K9me2的變化(200×)；b.相對熒光強度。不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下同a.The H3K9me2 status of BFFs(200×); b.The relative fluorescence intensity of BFFs.Different small letters mean significant difference among the groups (P<0.05)，same small letters mean not significant difference among the groups (P>0.05).The same as below圖3 UNC0638處理48 h后對BFFs組蛋白H3K9me2的影響Fig.3 Effect of H3K9me2 on BFFs after 48 h UNC0638 treatment

圖4 不同濃度UNC0638對轉(zhuǎn)基因BFFs eGFP基因表達的影響Fig.4 Effect of different concentration of UNC0638 on the expression of eGFP gene in transgenic BFFs

組蛋白是染色質(zhì)的核心，其尾部的乙酰化、磷酸化、甲基化等共同組成了組蛋白密碼并控制基因表達。組蛋白H3與H4賴氨酸甲基化參與多種生物學(xué)過程，包括轉(zhuǎn)錄的控制、DNA甲基化、異染色質(zhì)區(qū)域形成、X染色體的失活等[18-19]，一些效應(yīng)分子可特異性閱讀不同的賴氨酸甲基化密碼調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[20]。催化組蛋白賴氨酸甲基化的蛋白含有一個共同的結(jié)構(gòu)域(SET結(jié)構(gòu)域)，主要有Suv39h1、Suv39h2、EHMT2、EHMT1，其中EHMT2與EHMT1是控制常染色質(zhì)區(qū)域組蛋白甲基化的主要蛋白。組蛋白修飾在重編程過程中發(fā)揮重要的作用，H3K9me2修飾與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)[21-22]，并可調(diào)控Oct4在胚胎中的表達[23]。Chen等[8]報道，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞過程中組蛋白H3K9me2甲基化是抑制重編程的主要因素。此外，PGC7可以與含有H3K9me2的染色質(zhì)結(jié)合，阻斷TET3蛋白的主動去甲基化活性，以保護受精卵中的特異性的印記基因[13]。使用H3K9me2抑制劑BIX01294處理羊克隆胚胎可以顯著降低胚胎組蛋白H3K9me2水平，但對囊胚發(fā)育率無顯著影響[24]。Park等[25]指出BIX01294的高細(xì)胞毒性可能是影響胚胎發(fā)育的主要原因，阻礙了其在細(xì)胞重編程領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。UNC0638是一種新型的組蛋白甲基化抑制劑[14]，具更高效的組蛋白甲基化抑制效率與細(xì)胞毒性，因而在提高體細(xì)胞克隆效率和外源基因表達上有極高的利用價值。

Vedadi等[14]報道，UNC0638處理濃度大于0.5 μmol·L-1時可顯著降低人乳腺癌細(xì)胞株的H3K9me2水平。本研究基于此設(shè)置濃度梯度，在探討UNC0638對BFFs生長特性及細(xì)胞毒性的影響時發(fā)現(xiàn)，BFFs經(jīng)5.0 μmol·L-1濃度的UNC0638處理后細(xì)胞增殖減緩，處理48 h不影響細(xì)胞的核型正常率，結(jié)果與Vedadi等[14]報道的細(xì)胞毒性檢測試驗(MTT)結(jié)果相符，UNC0638藥物安全指標(biāo)(EC50)為(EC50=(11 000±710) nmol·L-1(n=3))，BIX01294為(EC50=(2 700±76) nmol·L-1(n=3))， 說明UNC0638較低的細(xì)胞毒性，一定濃度范圍內(nèi)不影響B(tài)FFs的生長特性與核型。對不同濃度UNC0638處理BFFs后，其組蛋白H3K9me2去甲基化能力分析，結(jié)果顯示，0.5 μmol·L-1UNC0638在處理BFFs 12 h，即可檢測到組蛋白H3K9me2甲基化水平的顯著降低， Fu等[26]報道使用0.1 μmol·L-1UNC0638處理牛供體細(xì)胞48 h，可檢測到H3K9me2甲基化水平的顯著降低。以上結(jié)果表明，低濃度UNC0638可顯著抑制組蛋白H3K9me2的甲基化水平。經(jīng)UNC0638處理后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因表達分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度UNC0638處理48 h，與對照組相比可顯著提高細(xì)胞eGFP的表達量，黃波[27]使用組蛋白去乙?；种苿㏕SA處理轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可增強eGFP基因的轉(zhuǎn)錄。該結(jié)果證實UNC0638可改變由表觀遺傳修飾導(dǎo)致的外源基因沉默，組蛋白H3K9me2可能是抑制轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因表達的因素之一。

張一軍[28]研究發(fā)現(xiàn)，山羊克隆胚胎經(jīng)UNC0638處理后，H3K9me2水平顯著下降與卵胞漿內(nèi)單精子注射胚胎不存在顯著差異，且克隆胚胎囊胚的Oct4和Nanog基因表達量與囊胚質(zhì)量顯著提高。UNC0638是否可以提高水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育率有待進一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，適宜濃度的UNC0638處理BFFs，不影響其細(xì)胞增殖與核型；UNC0638可顯著降低BFFs組蛋白H3K9me2甲基化水平，并提高水牛轉(zhuǎn)基因細(xì)胞外源基因的表達效率。