豬舍顆粒物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響

唐 倩，戴鵬遠(yuǎn)，吳 勝，沈 丹，李延森，李春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

畜舍內(nèi)空氣環(huán)境質(zhì)量是影響家畜健康和生產(chǎn)的重要因素。隨著畜牧業(yè)集約化程度的不斷提高，規(guī)?；i場(chǎng)舍內(nèi)飼養(yǎng)密度過(guò)高，通風(fēng)不良，導(dǎo)致豬舍內(nèi)空氣質(zhì)量問(wèn)題日益突出。豬舍內(nèi)產(chǎn)生的大量顆粒物(particulate matter，PM)嚴(yán)重?fù)p害了豬的健康和生產(chǎn)，進(jìn)而影響豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益[1]。PM是懸浮在氣體介質(zhì)中所有小固體顆粒和液體顆粒的總稱(chēng)，是一種同時(shí)攜帶多種污染物的混合物。根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)等效直徑大小，通常將PM分為總懸浮顆粒物(total suspended particulate，TSP，直徑≤100 μm)、可吸入顆粒物(PM10，直徑≤10 μm)和細(xì)顆粒物(PM2.5，直徑≤2.5 μm)三大類(lèi)。PM10和PM2.5顆粒細(xì)小，可隨呼吸進(jìn)入氣管和肺部，其中因PM2.5粒徑極小，比表面積較大，易吸附攜帶更多有害物質(zhì)，且可直接進(jìn)入肺泡，因此危害最大。由于豬舍內(nèi)環(huán)境復(fù)雜且污染源眾多，舍內(nèi)PM可攜帶內(nèi)毒素、致病菌、病毒等多種病原體，對(duì)豬群健康，尤其對(duì)呼吸道功能產(chǎn)生嚴(yán)重危害。肺泡巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)游離的免疫細(xì)胞，主要分布于呼吸道和肺泡表面，是肺抵御外源物質(zhì)入侵的第一道防線。當(dāng)動(dòng)物長(zhǎng)期暴露于高濃度PM環(huán)境下，肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能會(huì)受到損傷，細(xì)胞極化狀態(tài)發(fā)生改變，并產(chǎn)生大量促炎因子，進(jìn)而引發(fā)肺部乃至機(jī)體其他部位發(fā)生復(fù)雜的免疫反應(yīng)，影響動(dòng)物健康[2]。本文根據(jù)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究報(bào)道以及結(jié)合筆者課題組開(kāi)展的相關(guān)研究，從豬舍PM的特征及成分、PM對(duì)豬的健康和生長(zhǎng)性能的影響、PM對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)行綜述。

1 豬舍顆粒物的特征及成分

豬舍內(nèi)PM的產(chǎn)生和多種因素相關(guān)，包括豬的生長(zhǎng)階段、活動(dòng)強(qiáng)度及飼養(yǎng)密度[3]；飼料類(lèi)型、飼養(yǎng)管理及豬舍的構(gòu)造[4]；季節(jié)、豬舍的溫度、濕度及通風(fēng)情況[5]等。Cofala等[6]對(duì)不同豬舍和雞舍內(nèi)PM粒徑大小分布進(jìn)行分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)，肉雞舍中PM10和PM2.5占比較高，其次為豬舍(表1)。

表1畜舍中PM粒徑大小分析歸類(lèi)[6]

Table 1 Size distribution of PM in livestock houses[6]%

劉楊[7]對(duì)不同季節(jié)育肥豬舍內(nèi)PM粒徑進(jìn)行了分析(表2)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)季節(jié)中，大于PM10所占比例最高，均已超過(guò)60%，其中夏季甚至已經(jīng)超過(guò)75%，PM2.5在TSP中的占比以春季最低，只有3.69%，冬季為8.88%，秋季和夏季的占比接近或超過(guò)15%。筆者課題組對(duì)春季保育舍和育肥舍內(nèi)顆粒物濃度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)保育舍內(nèi)PM10/TSP為37.18%，PM2.5/TSP為24.86%，PM2.5/PM10為66.86%；育肥舍內(nèi)PM10/TSP為56.01%，PM2.5/TSP為43.70%，PM2.5/PM10為78.02%，兩舍內(nèi)PM2.5/PM10的值均超過(guò)60%，說(shuō)明兩舍內(nèi)PM10中大部分為PM2.5[8]。畜舍內(nèi)的PM攜帶多種有毒、有害物質(zhì)，包括內(nèi)毒素、重金屬離子、揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic chemcials，VOCs)、NO3-、SO42-、氨氣(NH3)、氣味化合物、抗生素、過(guò)敏原、塵螨及β-葡聚糖等[9-10]。其中，內(nèi)毒素對(duì)豬的健康和生產(chǎn)危害最大，它是革蘭陰性菌細(xì)胞膜的脂多糖成分，在細(xì)菌生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期以及細(xì)菌死亡崩解時(shí)會(huì)被釋放出來(lái)，其在豬舍中濃度最高可達(dá)6 970 EU·m-3[11]。關(guān)于豬舍內(nèi)PM上附著的細(xì)菌種類(lèi)以及內(nèi)毒素的含量，國(guó)內(nèi)學(xué)者做了相關(guān)的研究，李超等[12]對(duì)國(guó)內(nèi)不同豬場(chǎng)內(nèi)環(huán)境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬舍內(nèi)微生物種類(lèi)繁多，其中需氧革蘭陰性菌群主要有腸桿菌屬、假單胞菌屬、莫拉菌屬，內(nèi)毒素含量介于114～533 EU·m-3。另外，鞠雷等[13]對(duì)保育舍內(nèi)不同粒徑懸浮顆粒物細(xì)菌菌落進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌主要來(lái)自4個(gè)門(mén)、40個(gè)菌屬，其中2.1～3.3 μm 粒徑懸浮顆粒細(xì)菌菌群豐富度最高。

表2不同季節(jié)育肥豬舍內(nèi)不同粒徑顆粒物占比[7]

Table 2 Size distribution of PM in the fattening barns in different seasons[7]%

根據(jù)PM來(lái)源、化學(xué)組成和粒徑大小的不同，將其分為初級(jí)顆粒物和二次顆粒物[4]。初級(jí)顆粒物粒徑較大，可直接排放到舍外，其來(lái)源廣泛，化學(xué)成分中C、H、O、N、P和S含量豐富。豬舍內(nèi)初級(jí)顆粒物的來(lái)源主要分為動(dòng)物來(lái)源，包括皮膚、毛發(fā)、糞便和尿液、腸道菌群、腸上皮細(xì)胞和呼吸道細(xì)菌；墊料來(lái)源，包括植物細(xì)胞、霉菌、內(nèi)毒素、昆蟲(chóng)和微生物；飼料來(lái)源，包括蛋白酶、礦物質(zhì)、霉菌、內(nèi)毒素、昆蟲(chóng)和微生物；大氣來(lái)源，包括花粉粒、細(xì)菌芽胞和病原體。Donham[14]研究發(fā)現(xiàn)，豬舍中粗顆粒物(直徑≥10 μm)主要源自飼料顆粒，而細(xì)顆粒物(直徑≤10 μm)主要來(lái)源于糞便粒子，小部分來(lái)源于豬的皮屑，豬舍內(nèi)的霉菌和灰分等，這些糞便粒子源的細(xì)顆粒物能夠進(jìn)入肺泡，危害較粗顆粒物更大。然而，Aarnink等[15]則研究報(bào)道，豬舍PM主要來(lái)源于飼料和皮膚，造成這種差異的原因，可能是因?yàn)轱暳虾图S便中的有機(jī)物成分相似，區(qū)分PM是來(lái)源于飼料還是糞便中未被消化的飼料比較困難，這就容易導(dǎo)致在對(duì)豬舍PM進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估時(shí)，高估飼料來(lái)源，而低估糞便來(lái)源[16]。而二次顆粒物主要是以氨氣為前體，和H2SO4、HNO3及HCl等氣體進(jìn)行反應(yīng)后，形成固體或液體的二次無(wú)機(jī)粒子，主要包括硫酸銨、硫酸氫銨、硝酸銨和氯化銨等[17]。目前，關(guān)于二次顆粒物在總懸浮顆粒物中所占比例仍不清楚，但Roumeliotis和Van Heyst[18]研究報(bào)道，約50%的PM2.5源自于二次顆粒物。

2 豬舍顆粒物對(duì)豬的生長(zhǎng)性能和呼吸道健康的影響

豬舍內(nèi)PM會(huì)影響豬的生產(chǎn)性能，研究表明舍內(nèi)PM濃度過(guò)高，可使豬的生長(zhǎng)性能下降8%～10%[19]。究其原因，可能有兩方面的因素，一是豬吸入PM后，會(huì)引發(fā)免疫應(yīng)答，促炎因子釋放，采食欲降低，導(dǎo)致豬的采食量減少[20]；二是由PM激活的免疫應(yīng)答會(huì)改變豬體內(nèi)的代謝過(guò)程，代謝過(guò)程的改變會(huì)導(dǎo)致用于生長(zhǎng)的部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)重新分配到免疫系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的生長(zhǎng)速度減慢和飼料利用率下降[21]。另外，在免疫反應(yīng)中，被激活的單核免疫細(xì)胞釋放的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α?xí)ㄟ^(guò)降低合成代謝激素(如生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子)的釋放，以及增加分解代謝激素(如糖皮質(zhì)激素)的釋放，影響血液中葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡，增加蛋白質(zhì)的氧化，加快肌肉蛋白質(zhì)的水解，導(dǎo)致原本用以生長(zhǎng)和沉積于骨骼肌的能量用于支持免疫應(yīng)答產(chǎn)生的各種代謝反應(yīng)，減少機(jī)體蛋白質(zhì)的沉積，進(jìn)而影響豬的生長(zhǎng)性能[22]。

此外，PM濃度過(guò)高還會(huì)對(duì)豬的呼吸道產(chǎn)生損害。Donham[23]研究表明，豬舍內(nèi)PM濃度過(guò)高，可增加豬的肺炎和胸膜炎的發(fā)病率和死亡率。也有研究表明，豬舍內(nèi)PM導(dǎo)致豬呼吸道功能紊亂和鼻黏膜受損[24]。這主要因?yàn)樨i舍PM攜帶氨氣、內(nèi)毒素、葡聚糖、致病菌等多種有害物質(zhì)，且PM2.5粒徑小，極易被吸入肺泡，直接刺激肺泡巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)和免疫刺激，影響肺的正常功能，而且肺釋放的促炎因子也會(huì)隨血液進(jìn)入全身，引起全身性的免疫反應(yīng)。

3 顆粒物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響

肺泡巨噬細(xì)胞作為肺部和氣道抵御外源物質(zhì)的第一道防線，在維持肺部免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)以及宿主防御的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[25]。由于PM2.5粒徑極小，可被直接吸入肺泡，危害較大。通常情況下，肺泡巨噬細(xì)胞可將吸入肺內(nèi)的PM2.5吞噬、溶解、清除[26]，但當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度PM環(huán)境下，則會(huì)誘發(fā)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一系列復(fù)雜的先天免疫反應(yīng)及適應(yīng)性免疫反應(yīng)，主要包括影響吞噬功能、改變細(xì)胞極化狀態(tài)、識(shí)別模式識(shí)別受體(Toll樣識(shí)別受體和清道夫識(shí)別受體)，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1，產(chǎn)生大量促炎因子。

3.1 顆粒物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

為抵御PM對(duì)呼吸道造成的損傷，黏膜防御系統(tǒng)會(huì)通過(guò)多種機(jī)制清除這些異物[27]。纖毛的扶梯運(yùn)輸是鼻、咽和支氣管抵御外界侵染物的第一道防線，而一些沒(méi)有被纖毛清除完全的，進(jìn)入到肺泡中的細(xì)顆粒物則會(huì)被支氣管上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬。由于巨噬細(xì)胞的吞噬能力比支氣管上皮細(xì)胞強(qiáng)[28]，因此肺泡巨噬細(xì)胞在清除氣道和肺泡有害環(huán)境中微小組分發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)肺泡中沉積的PM過(guò)多時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致其吞噬能力降低。Knetter等[1]研究發(fā)現(xiàn)，豬舍PM會(huì)降低豬肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力及其細(xì)胞殺傷能力，同時(shí)能顯著提高CD163蛋白的表達(dá)水平，而CD163與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染靶細(xì)胞高度相關(guān)。有學(xué)者通過(guò)體外試驗(yàn)[29-30]發(fā)現(xiàn)，豬舍PM可降低人和小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞吞噬能力下降的原因，可能是因?yàn)镻M表面攜帶的許多有害物質(zhì)易引起肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，從而下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記蛋白、巨噬細(xì)胞甘露糖受體CD206和調(diào)理素受體CD11b/CD11c，進(jìn)而降低肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力[31]。

3.2 顆粒物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞極性的改變

巨噬細(xì)胞是具有不同表型極化的細(xì)胞群，不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞在宿主抵抗病原微生物、腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著不同的功能和作用。根據(jù)巨噬細(xì)胞的表型，通常將巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典激活途徑巨噬細(xì)胞(M1型)和替代激活途徑巨噬細(xì)胞(M2型)。在IFN-γ及LPS的刺激下，休眠狀態(tài)的巨噬細(xì)胞(M0)會(huì)誘導(dǎo)極化為M1型細(xì)胞，分泌大量的促炎因子(如IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶等)和趨化因子(如MCP-1、CCL2-4、CXCL8-11)，并通過(guò)趨化性吸引Th1細(xì)胞，促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)。與之相反的是，巨噬細(xì)胞會(huì)在IL-13、IL-4、免疫復(fù)合物或是IL-10的刺激下，誘導(dǎo)為M2型，并釋放大量的抑炎因子(IL-4、IL-13和IL-10等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、精氨酸酶-1、血小板源生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等。M2型巨噬細(xì)胞在血管生成、抗炎因子分泌以及促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合方面發(fā)揮著重要的作用[32]。同時(shí)，巨噬細(xì)胞具有高度可塑性、局部組織功能特異性，炎癥因子誘導(dǎo)下分化異常等特點(diǎn)。當(dāng)外源物質(zhì)入侵機(jī)體時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)極化為M1型，產(chǎn)生大量促炎因子，消滅入侵的外源物質(zhì)，并激活適應(yīng)性免疫。同時(shí)這些炎癥因子又可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡或向M2型巨噬細(xì)胞極化，減輕炎癥，避免機(jī)體過(guò)度損傷[33]。

通過(guò)PM暴露小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中M1型細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IFN-γ)顯著增加，而M2型細(xì)胞因子(IL-13和IL-10)則維持在較低的水平[34]。此結(jié)論也在體外試驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，大氣來(lái)源的PM10刺激人的肺泡巨噬細(xì)胞后，產(chǎn)生了大量的促炎癥因子，但是IL-10的水平?jīng)]有提高[35]。以上研究結(jié)果都表明，PM刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，會(huì)促使其向M1型極化。此外，PM還會(huì)改變肺泡巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，PM刺激M1型肺泡巨噬細(xì)胞后，會(huì)產(chǎn)生大量的促炎介導(dǎo)因子，并招募其他免疫細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞，當(dāng)PM被吞噬內(nèi)化后，這些細(xì)胞會(huì)凋亡，從而使肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)為M2型細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子來(lái)緩解PM刺激后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而PM會(huì)在一定程度上阻止肺泡巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變，加重炎癥反應(yīng)[36](圖1)。PM引起肺泡巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)改變的機(jī)制，可能是由于PM刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，引起線粒體損傷，繼而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)其向M1狀態(tài)極化，同時(shí)通過(guò)激活mTOR途徑抑制其向M2狀態(tài)極化[37]。

圖1 PM對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響[36]Fig.1 The impact of PM exposure on alveolar macrophage phenotype [36]

3.3 顆粒物對(duì)模式識(shí)別受體(PRR)的激活

3.3.1 Toll樣識(shí)別受體(TLRs) TLRs是激活先天免疫的第一步，它可以直接識(shí)別來(lái)自微生物病原體的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)[38]。豬舍PM中的多種生物成分(如LPS、β-葡聚糖、細(xì)菌組分和真菌孢子)都存在與TLRs相互作用的潛在機(jī)制[39]。在13個(gè)TLRs中，TLR2和TLR4是連接PM最主要的兩個(gè)受體。豬場(chǎng)PM中的革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的內(nèi)毒素和革蘭陽(yáng)性菌中的酵母聚糖、肽聚糖可分別與TLR4和TLR2受體結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，在細(xì)胞膜上，TLR4和TLR2分別有各自的配體，與支氣管上皮細(xì)胞相比，肺泡巨噬細(xì)胞膜上的TLR4是它的10倍[40]。Becker等[40]通過(guò)PM10處理細(xì)胞的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷TLR4表達(dá)后，肺泡巨噬細(xì)胞中IL-6的釋放被抑制，而阻斷TLR2后，氣道上皮細(xì)胞中IL-8的釋放被抑制。另外，He等[41]通過(guò)TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)，檢測(cè)肺泡灌洗液中的免疫因子，發(fā)現(xiàn)PM主要通過(guò)TLR4/MyD88這一途徑引起免疫反應(yīng)，其次為T(mén)LR2/MyD88途徑。大量的試驗(yàn)證明，TLR2/4參與了由PM引起的先天免疫反應(yīng)，但是關(guān)于PM如何調(diào)節(jié)這些受體表達(dá)的機(jī)制，目前依然沒(méi)有統(tǒng)一的定論。He等[42]將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7暴露于濃度為3 μg·mL-1PM10中3 h，發(fā)現(xiàn)PM10顯著提高了細(xì)胞TLR2 mRNA的表達(dá)量。Alexis等[43]把人肺泡巨噬細(xì)胞暴露于PM2.5-10中3 h，發(fā)現(xiàn)TLR4的mRNA表達(dá)水平顯著增高。但是，Becker等[44]將人肺泡巨噬細(xì)胞暴露于PM中18 h 后則發(fā)現(xiàn)，TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)水平均顯著降低；Williams等[45]把樹(shù)突細(xì)胞暴露于PM2.5中48 h，也得出相似的變化趨勢(shì)，這些結(jié)果可能由于暴露時(shí)間不同所致。PM短時(shí)間暴露(3 h)，TLRs表達(dá)量升高，可能是由于細(xì)胞產(chǎn)生大量的促炎因子所致；而長(zhǎng)時(shí)間暴露(18或48 h)，TLRs表達(dá)量則會(huì)降低，可能是由于前期產(chǎn)生的大量促炎因子在后期又負(fù)向調(diào)節(jié)了TLR的表達(dá)所致。但無(wú)論變化趨勢(shì)如何，上述研究結(jié)果都表明了PM暴露后，TLRs在肺相關(guān)細(xì)胞的免疫反應(yīng)中具有重要作用，并且以TLR4最為關(guān)鍵。

3.3.2 清道夫受體(SR-A) 在巨噬細(xì)胞吞噬外源物質(zhì)之前，會(huì)首先發(fā)揮其調(diào)理作用(即抗體、補(bǔ)體與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬微生物等顆粒性抗原的作用)，PM中的微生物組分會(huì)經(jīng)過(guò)特定的調(diào)理素(抗體或補(bǔ)體)調(diào)理后，被肺泡巨噬細(xì)胞中調(diào)理素相關(guān)的吞噬受體(Fc受體、補(bǔ)體受體和凝結(jié)素受體)識(shí)別而被吞噬[46]，然而由于PM中的無(wú)機(jī)成分未被調(diào)理過(guò)，所以不能被調(diào)理素相關(guān)的吞噬受體識(shí)別，但其會(huì)被另一個(gè)重要模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)——A類(lèi)清道夫受體(scavenger receptor A，SR-A)識(shí)別。SR-A主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，并在非特異性吞噬未被調(diào)理過(guò)的PM中發(fā)揮重要作用[47]。依據(jù)功能不同可將PRRs分為信號(hào)傳導(dǎo)PRRs和胞吞PRRs兩種。信號(hào)傳導(dǎo)PRRs(如TLRs)只介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑，并不介導(dǎo)病原體的吞噬，而SR-A不僅介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，還參與病原體的黏附、吞噬和消化。PM中的微生物組分會(huì)經(jīng)過(guò)特定的調(diào)理素(抗體或補(bǔ)體)進(jìn)行調(diào)理，另外，有研究表明PM中的無(wú)機(jī)成分除了與SR-A結(jié)合外，還能與甘露糖受體及β2整合素結(jié)合。但當(dāng)PM作用于這些PRRs后，促炎因子的釋放卻與PM作用于TLR的結(jié)果相反，原因在于SR-A受體激活會(huì)導(dǎo)致促炎因子的降低，以防止肺組織中中性粒細(xì)胞的涌入[47]。此外，有研究表明，SRM1648(PM10的標(biāo)準(zhǔn)品)通過(guò)激活Caspase-3引起肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡，但是這種凋亡可被SR-A的抑制劑阻斷[48]。目前，關(guān)于SR-A如何緩解免疫反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。

3.4 肺泡巨噬細(xì)胞中TLR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB和AP-1)的激活

研究表明，PM暴露會(huì)引起肺細(xì)胞炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等)的釋放[49-50]，其中，NF-κB和AP-1是目前研究與PM暴露后引起炎癥反應(yīng)最多的兩種轉(zhuǎn)錄因子。豬舍PM中的微生物成分是轉(zhuǎn)錄因子激活的有效刺激物，其可通過(guò)識(shí)別TLRs繼而激活其下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1。

NF-κB是一種可被細(xì)胞表面受體(如TLRs)激活的細(xì)胞膜受體，它還可以作為潛在的細(xì)胞質(zhì)因子以及細(xì)胞質(zhì)中p65和p50蛋白之間的異質(zhì)二聚體，與抑制蛋白IκBα結(jié)合[51]。當(dāng)巨噬細(xì)胞被PM刺激后，抑制蛋白IκBα就會(huì)從異質(zhì)二聚體上游離出來(lái)，使得異質(zhì)二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)入核，與特定的DNA序列結(jié)合，激起下游炎癥因子的釋放。以上論述表明，PM刺激肺泡巨噬細(xì)胞后會(huì)通過(guò)NF-κB通路產(chǎn)生大量的促炎因子。而NF-κB的激活是由于肺巨噬細(xì)胞受PM刺激產(chǎn)生的ROS所致。PM引起肺巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子釋放，從而激活NF-κB，促使其下游促炎因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等)的表達(dá)上調(diào)[52]。ROS激活NF-κB啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的同時(shí)，也會(huì)激活氧化還原敏感的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 啟動(dòng)細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。ROS的作用機(jī)制較為復(fù)雜，在氧化應(yīng)激過(guò)程中，Nrf2和NF-κB均和ROS呈劑量依賴(lài)性。低水平的ROS會(huì)引起相關(guān)抗氧化酶的釋放，而中高水平的ROS則會(huì)引起NF-κB和MAPKs(ERK、JNK和p38)的激活，增加細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[53]，而被激活的MAPKs則通過(guò)下游轉(zhuǎn)錄因子(AP-1)的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)其下游基因促炎因子的表達(dá)。目前，已有大量試驗(yàn)使用肺泡Ⅱ型細(xì)胞作為研究MAPK通路的細(xì)胞模型，而在肺泡巨噬細(xì)胞中研究較少[54]。

4 顆粒物對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的影響

肺泡巨噬細(xì)胞是重要的抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)，當(dāng)PM被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)化后，PM中的有機(jī)成分(如LPS、β-葡聚糖、細(xì)菌組分或真菌孢子)會(huì)被消化為小肽片段，與組織相容性復(fù)合體(major histcompatibility complex，MHC)Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合形成MHC Ⅱ復(fù)合體，將抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞，這是細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵步驟[55-56]。研究表明，LPS刺激可上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞中MHCⅡ表達(dá)，因此，吸入含有內(nèi)毒素的PM后也會(huì)引起肺泡巨噬細(xì)胞中MHCⅡ表達(dá)上調(diào)[45]。Alexis等[43]通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)，使志愿者吸入6.35 mg的PM2.5-10，發(fā)現(xiàn)志愿者的支氣管灌洗液中MHCⅡ表達(dá)水平上調(diào)。而當(dāng)經(jīng)過(guò)熱處理去除PM中的微生物相關(guān)成分后，MHC Ⅱ的過(guò)量表達(dá)被抑制了，因此可以得出結(jié)論，PM中的微生物相關(guān)成分是引起MHCⅡ上調(diào)的主要原因。與此同時(shí)，熱處理?yè)p害的不僅僅是微生物的相關(guān)成分，還會(huì)損傷如PAH等有機(jī)揮發(fā)性成分。而相反的是，體外試驗(yàn)中未檢測(cè)到MHC Ⅱ表達(dá)水平的升高，原因是體外試驗(yàn)中缺乏LPS結(jié)合蛋白和CD14，而LPS需要和LPS結(jié)合蛋白結(jié)合，才能將LPS傳遞到細(xì)胞表面模式識(shí)別受體CD14引發(fā)免疫反應(yīng)。

除了抗原特異性的MHC和T細(xì)胞受體外，T細(xì)胞還需要共刺激信號(hào)才能被完全激活。共刺激信號(hào)有兩種，CD80/CD86和CD40L，其在激活的CD4+T細(xì)胞上都有相應(yīng)的配體，CD80/86與配體CD28和CD152結(jié)合，CD40L 與配體CD154 (CD40) 結(jié)合，從而使CD4+T細(xì)胞極化為T(mén)h1或Th2型[57]。而這些信號(hào)分子會(huì)在APC的膜上表達(dá)，當(dāng)成熟的肺泡巨噬細(xì)胞被激活時(shí)，其吞噬功能會(huì)下降，同時(shí)MHC Ⅱ和共刺激分子會(huì)上調(diào)。

目前，對(duì)PM刺激肺泡巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)Th1/Th2分化的研究結(jié)果不一致。在PM暴露小鼠的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中Th1細(xì)胞因子(IL-12和IFN-γ)的表達(dá)水平上調(diào)[58]，而Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和IL-13)表達(dá)水平下降[59]。然而，亦有研究表明，PM會(huì)增強(qiáng)肺中Th2免疫反應(yīng)，加劇過(guò)敏性哮喘和急性哮喘[60]。這種矛盾觀點(diǎn)產(chǎn)生的主要原因是因?yàn)镻M的組成成分復(fù)雜，其中的微生物組分(內(nèi)毒素和過(guò)渡金屬)刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，產(chǎn)生大量的ROS，而Th1細(xì)胞的主要作用是攻擊細(xì)胞內(nèi)的病原體和LPS，其通過(guò)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)被激活并釋放IL-12，促使Th1分化，因此，Th1分化是PM中微生物組分刺激肺泡巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)的自然生理過(guò)程。而導(dǎo)致Th2分化的原因是由于氧化應(yīng)激造成的，谷胱甘肽是中和ROS的主要抗氧化劑，且可以通過(guò)干擾IL-4的產(chǎn)生促進(jìn)Th1分化，而氧化應(yīng)激可將谷胱甘肽氧化，所以過(guò)量的氧化應(yīng)激會(huì)使谷胱甘肽相對(duì)缺乏，導(dǎo)致Th2分化[61]。關(guān)于PM影響Th1/Th2分化的過(guò)程十分復(fù)雜，且目前相關(guān)研究報(bào)道也較少，其影響的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

另外，TLRs的識(shí)別以及NF-κB的激活介導(dǎo)的先天性免疫對(duì)于適應(yīng)性免疫反應(yīng)也是必不可少的。NF-κB激活可以促進(jìn)APC成熟，MHCⅡ和共刺激分子表達(dá)水平上調(diào)以及IL-12表達(dá)水平上升，其中IL-12是Th1細(xì)胞分化的重要因子[62]。由于NF-κB的激活對(duì)PM呈劑量依賴(lài)性，由此我們也可以推測(cè)先天性免疫和NF-κB的激活在PM引起的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中也存在著劑量依賴(lài)關(guān)系。

5 結(jié)語(yǔ)和展望

肺泡巨噬細(xì)胞不僅是肺抵御外源物質(zhì)的第一道防線，也是肺中的游離免疫細(xì)胞，它的主要功能是吞噬和清除吸入的PM，而在此過(guò)程中就會(huì)引起一系列的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。PM刺激肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，同時(shí)PM還會(huì)與TLRs結(jié)合，繼而引起下游的轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB和AP-1)激活，釋放大量的促炎因子，引起局部以及全身的免疫反應(yīng)。另外，肺泡巨噬細(xì)胞還能作為APC，引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)(圖2)。

圖2 PM暴露肺泡巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[63] Fig.2 Innate and adaptive immunity induced by PM in alveolar macrophage[63]

豬舍PM，特別是小粒徑的PM10和PM2.5，其組成成分復(fù)雜，對(duì)豬乃至人的健康危害較大，越來(lái)越引起人們的重視。國(guó)內(nèi)對(duì)豬舍PM相關(guān)研究起步較晚，缺乏相關(guān)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，很多源解析的數(shù)據(jù)仍需借鑒國(guó)外的能譜。但是，由于不同國(guó)家地域的豬舍構(gòu)造、豬的品種、飼料組成和飼養(yǎng)管理都不盡相同，所以許多國(guó)外學(xué)者的豬舍PM源解析研究數(shù)據(jù)與我國(guó)實(shí)際情況存在很多差異。因此，針對(duì)中國(guó)的規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)PM組成成分的源解析和關(guān)鍵致毒成分的確定以及對(duì)免疫系統(tǒng)影響的機(jī)制研究是今后科學(xué)研究中有待解決的主要問(wèn)題。

另外，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等體外試驗(yàn)法來(lái)研究PM對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康的影響機(jī)制，而缺乏對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)，因此在今后的研究中，應(yīng)多采用體內(nèi)外試驗(yàn)相結(jié)合的研究方法，以更加系統(tǒng)、準(zhǔn)確地研究PM對(duì)家畜健康的影響機(jī)制。