響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取陳皮中橙皮苷工藝的研究

謝 捷，曹銘希，朱興一，王 平

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，制藥工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014）

響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取陳皮中橙皮苷工藝的研究

謝 捷，曹銘希，朱興一，王 平*

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，制藥工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014）

采用響應(yīng)面法對(duì)陳皮中橙皮苷的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比三個(gè)主要因素，以橙皮苷得率為響應(yīng)值，用響應(yīng)面分析法優(yōu)化橙皮苷的閃式提取工藝。結(jié)果表明，閃式提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，提取時(shí)間2.6min，液固比42.1mL/g，閃式提取2次。在此條件下，橙皮苷得率的理論值為5.39%，實(shí)測(cè)值為5.36%，與理論值的相對(duì)誤差為0.56%。與乙醇熱回流法相比，橙皮苷得率提高了6.35%，提取時(shí)間大大縮短。閃式提取法是一種高效快速的提取橙皮苷的方法。

響應(yīng)面，閃式提取，陳皮，橙皮苷

Abstract：Response surface methodology was applied to optimize the homogenate extraction of hesperidin from pericarpium citri reticulatae.On the base of single factor experiments，ethanol concentration，extraction time and the ratio of solvent to solid were selected as the main factors.The yield of hesperdin was used as the responsive values.The response surface method was employed to optimize the homogenate extraction of hesperidin.The results indicated that the optimum conditions were as follows：the concentration of ethanol of 70%，the extraction time of 5min，the ratio of solvent to solid of 42.1mL/g and homogenate extraction for 2 times.Under the optimum extraction conditions，the predictive yield of hesperdin was 5.39%，the average validation yield of hesperidin was 5.36%，and the relative error between them was 0.56%.Compared with heating reflux extraction，the yield using the homogenate extraction was 6.35%higher and extraction time was significantly shortened.So the homogenate extraction was efficient and rapid to extract hesperdin.

Key words：response surface methodology；homogenate extraction；pericarpium citri reticulatae；hesperidin

陳皮（Pericarpium Citri Reticultae）為蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮［1］，具有“理氣健脾、燥濕化痰”的功效。橙皮苷是陳皮的主要活性成分之一，為白色針狀晶體，化學(xué)結(jié)構(gòu)為具有雙氫黃酮氧苷結(jié)構(gòu)［2］。研究表明，橙皮苷具有鎮(zhèn)咳平喘［3］、抗病毒［4］、抗菌［5］、止痛［6］、抗氧化［7］等功效。目前，橙皮苷的提取主要以乙醇熱回流法為主，耗時(shí)長(zhǎng)、得率較低［8］。另外也有采用超聲波輔助法提取橙皮苷，提取效果較好，但提取時(shí)間略長(zhǎng)［9］。閃式提取是利用閃式提取器高速轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的機(jī)械剪切作用、振動(dòng)作用和負(fù)壓渦流，迅速地將植物細(xì)胞組織粉碎至細(xì)微粒度，從而使組織內(nèi)的有效成分與溶劑充分接觸，達(dá)到快速溶解和高效提取的目的［10］，具有時(shí)間短、效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［11］。目前，有關(guān)閃式提取橙皮苷的工藝還未有報(bào)道，本文嘗試將閃式提取法應(yīng)用于橙皮苷的提取，并通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化該工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

陳皮 購(gòu)于杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，干燥粉碎后過(guò)30目篩；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙酸 色譜純；無(wú)水乙醇 分析純。

DFY-500搖擺式粉碎機(jī) 上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司；DZF真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FSH22可調(diào)閃式提取器 鄭州金星科技有限公司；Agilent液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橙皮苷的閃式提取 準(zhǔn)確稱取陳皮粗粉10.0g，加入一定量溶劑，在一定的乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比和提取次數(shù)下進(jìn)行閃式提取，過(guò)濾得橙皮苷提取液。

1.2.2 橙皮苷的乙醇熱回流提取 準(zhǔn)確稱取陳皮粗粉10.0g，加入40倍70%的乙醇回流提取2h，重復(fù)2次，過(guò)濾得橙皮苷提取液。

1.2.3 橙皮苷含量的測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil（TM）C18（250mm ×4.6mm，5!m）；甲醇-水-乙酸（35∶61∶4），流速為 1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 UV 286nm，柱溫為30℃。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品3.9mg，用甲醇溶解，并定容至25mL。分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30、35、40!L，進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)。以進(jìn)樣量（!g）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為 Y=0.0006X+0.0086（R2=0.9999），線 性 范 圍 為 0.0373～0.2931mg/mL。

1.2.3.3 橙皮苷得率的計(jì)算 吸取橙皮苷提取液10mL，用甲醇定容至50mL。精密吸取經(jīng)0.45!m微孔膜濾過(guò)的濾液10!L，按上述色譜條件檢測(cè)。根據(jù)回歸方程求得橙皮苷的濃度，按下式計(jì)算橙皮苷得率：

式中：Y為橙皮苷得率，%；c為橙皮苷濃度，g/mL；v為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為陳皮質(zhì)量，g。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比和提取次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面分析軟件提供的模型，選取對(duì)提取工藝影響較大的乙醇濃度、提取時(shí)間、液固比為自變量，橙皮苷的得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)橙皮苷得率的影響

2.1.1 乙醇濃度對(duì)橙皮苷得率的影響 固定實(shí)驗(yàn)條件：提取時(shí)間為2.5min，液固比為40mL/g，提取次數(shù)為2次，考察乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果如圖1所示。由于橙皮苷能溶于乙醇，而在水中的溶解性較差。在乙醇濃度為50%～70%時(shí)，得率隨乙醇濃度的增加而增加。當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，陳皮中的果膠多糖會(huì)發(fā)生凝固，阻礙了乙醇向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散，也影響了橙皮苷的有效溶出，因此，得率逐漸下降。本實(shí)驗(yàn)選擇70%作為較適宜的乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)橙皮苷得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響 固定實(shí)驗(yàn)條件：乙醇濃度為70%，液固比為40mL/g，提取次數(shù)為2 次，考察提取時(shí)間分別為 0 .5、1、1.5、2、2.5、3.0min對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果如圖2所示。提取時(shí)間在0.5～2.5min的范圍內(nèi)，高速的機(jī)械剪切作用使橙皮苷更易從基質(zhì)中釋放并溶解，得率隨時(shí)間的增加而增加，2.5min時(shí)達(dá)到最高。此后再延長(zhǎng)時(shí)間，由于橙皮苷在高溫條件下發(fā)生分解，得率隨之下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2.5min作為較適宜的閃式提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對(duì)橙皮苷得率的影響

2.1.3 液固比對(duì)橙皮苷得率的影響 固定實(shí)驗(yàn)條件：乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為2.5min，提取次數(shù)為2 次，考察液固比分別為 20、30、40、50、60mL/g 時(shí)對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果如圖3所示。液固比在20～40mL/g的范圍內(nèi)，溶劑量的增加使橙皮苷更易充分溶出，得率隨之提高，液固比為40mL/g時(shí)達(dá)到最高。此后再增加液固比，橙皮苷得率幾乎保持恒定。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇40mL/g作為較適宜的液固比。

圖3 液固比對(duì)橙皮苷得率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)橙皮苷得率的影響 固定實(shí)驗(yàn)條件：乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為2.5min，液固比為

40mL/g，考察提取次數(shù)對(duì)橙皮苷得率的影響，結(jié)果如圖4所示。得率隨著提取次數(shù)的增加而提高，當(dāng)提取2次時(shí)，基本提取完全。因此，選擇2次作為最適宜的閃式提取次數(shù)，在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中不再作為考察因素。

圖4 提取次數(shù)對(duì)橙皮苷得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取橙皮苷工藝

根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)橙皮苷得率影響較大的三個(gè)因素：乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比，采用Design-Expert7.0程序，進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化。分別對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間和液固比作如下變換：X1=（Z1-70）/10，X2=（Z2-2.5）/0.5，X3=（Z3-40）/10，橙皮苷得率Y為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，其中1～12是析因?qū)嶒?yàn)，13～15是中心實(shí)驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差?；貧w結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

該回歸模型極顯著（P＜0.001），表明與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好。決定系數(shù)R2=99.10%，表明響應(yīng)值的變化有99.10%來(lái)源于所選變量。模型失擬項(xiàng)P=0.4415＞0.05，不顯著，表明本實(shí)驗(yàn)無(wú)其他因素的顯著影響，回歸模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均對(duì)橙皮苷得率的影響顯著，交互項(xiàng)的影響小。根據(jù)回歸分析結(jié)果，得響應(yīng)面及其等高線如圖5～圖7所示。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值。由圖5可知，X1和X2的等高線呈橢圓形，同時(shí)橙皮苷得率對(duì)乙醇濃度的變化比對(duì)提取時(shí)間的變化敏感。由圖6可知，X1和X3的等高線也呈橢圓形，且橙皮苷得率對(duì)乙醇濃度的變化比對(duì)液固比的變化敏感。由圖7可知，X2和X3的等高線幾乎呈圓形，提取時(shí)間和液固比的交互作用很小。綜合以上分析，乙醇濃度是影響橙皮苷得率的主要因素，其次是液固比，而提取時(shí)間對(duì)橙皮苷得率影響較小。

圖5 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面和等高線

圖6 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面和等高線

圖7 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面和等高線

對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)并解方程組可得：X1=-0.067，X2=0.0913，X3=0.2063。代入前述的變換公式，可得橙皮苷最佳提取工藝條件為：乙醇濃度69.33%、提取時(shí)間2.55min、液固比42.06mL/g?？紤]到實(shí)際情況，將最佳提取工藝條件修正為乙醇濃度70%、提取時(shí)間2.6min、液固比42.1mL/g。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

根據(jù)以上最佳條件進(jìn)行橙皮苷的提取，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，橙皮苷的實(shí)際得率為5.36%，與理論值5.39%的相對(duì)誤差為0.56%，表明響應(yīng)面分析法得到的工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.4 不同提取工藝比較

將陳皮粗粉按1.2.2中所示的提取條件進(jìn)行乙醇熱回流提取，并與閃式提取進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4 不同提取工藝的比較（n=3）

與乙醇熱回流提取相比，閃式提取橙皮苷的得率提高了6.35%，提取時(shí)間由2h縮短到2.5min。閃式提取利用高速機(jī)械剪切力和振動(dòng)作用使植物組織迅速破碎，繼而有效成分在負(fù)壓滲透的作用下快速達(dá)到溶解平衡，因而提取效率得到顯著提高。

3 結(jié)論

3.1 探索了橙皮苷的閃式提取工藝，并用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了最佳工藝條件：乙醇濃度70%、提取時(shí)間2.6min、液固比42.1mL/g、提取2次。在此工藝條件下，橙皮苷的實(shí)際得率達(dá)5.36%，與理論值基本相符。

3.2 與乙醇熱回流法相比，閃式提取橙皮苷的得率提高了6.35%，時(shí)間更短，是一種高效提取橙皮苷的方法。

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Optimization for homogenate extraction of hesperidin from pericarpium citri reticu/atae by using response surface methodology

XIE Jie，CAO Ming-xi，ZHU Xing-yi，WANG Ping*
（Zhejiang University of Technology，College of Pharmaceutical Sciences，Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education，Hangzhou 310014，China）

TS255.1

B

1002-0306（2010）10-0285-04

2009-10-09 *通訊聯(lián)系人

謝捷（1978-），女，碩士，講師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

浙江省重大科技專項(xiàng)（2008C13036-3）。