蒙藥藍(lán)盆花UHPLC特征圖譜研究*

★ 劉艷紅 歐陽(yáng)輝 黃小方 黎田兒 周茂福*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

藍(lán)盆花屬ScabiosaL.植物隸屬于川續(xù)斷科(Dipsacaceae)，約100種，產(chǎn)歐洲、亞洲、非洲南部和西部，主產(chǎn)地中海地區(qū)。我國(guó)有9種2變種，產(chǎn)東北、華北、西北及臺(tái)灣等地[1]。據(jù)《中華本草》記載，其中窄葉藍(lán)盆花 (ScabiosaComosaFisch)和華北藍(lán)盆花 (ScabiosaTschilliensisGrunning )在我國(guó)蒙古族境內(nèi)作為蒙藥廣泛使用?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 (蒙藥分冊(cè))中規(guī)定兩者的花序均作為正品藥用。其蒙藥名為套森-套日麻[2]，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等省區(qū)[3-4]。具有甘、澀、鈍、燥、膩、重、涼等性味；清熱、清“協(xié)日”之功能；蒙藏醫(yī)多用于肺熱、肝熱、咽喉熱等疾病的治療[5]。其臨床應(yīng)用多為配方用，與木通、石竹等配伍治療肝熱病、肝中毒、肝性消瘦；與紅花、梔子等配伍治療肝熱及肺熱咳嗽；與天竺黃、沙棘等配伍治療肺熱咳嗽[5]。藍(lán)盆花現(xiàn)有的指紋圖譜不足以全面評(píng)價(jià)其藥材所含化學(xué)成分的種類(lèi)和數(shù)量。目前有部分學(xué)者已建立藍(lán)盆花的指紋圖譜[6-7]，但是采用超高效液相色譜UHPLC建立藍(lán)盆花特征圖譜和同時(shí)使用MS定性研究目前還未見(jiàn)報(bào)道。相對(duì)于常規(guī)的HPLC而言，UHPLC具有更好的分離效率和靈敏度，且色譜分析時(shí)間更短，應(yīng)用范圍更廣。本文對(duì)藍(lán)盆花指紋圖譜UHPLC條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用UHPLC-Q-Tof-MS/MS技術(shù)對(duì)其色譜峰進(jìn)行成分定性分析，以期為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器與材料

日本島津LC-30ADXR超高效液相色譜儀，SPD-30A 紫外檢測(cè)器，島津LC-Solution 工作站，電子天平(萬(wàn)分之一，Sartorius)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ250DB，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，藍(lán)盆花藥材(從內(nèi)蒙、吉林等地收集，共10批次)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國(guó)躍教授鑒定為正品。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，對(duì)照品木犀草苷(批號(hào)：111720-201408，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 Welch Ultimate UHPLC C18柱(2.1×100 mm，1.7μm)色譜柱，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為0.3%磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫條件見(jiàn)表 1，流速為0.25 mL·min-1，柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量3μL。

表1 梯度洗脫色譜條件

2.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末約0.5g，精密稱(chēng)定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)重，超聲30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性考察 分別取同一批藍(lán)盆花樣品適量，共 6 份，精密稱(chēng)定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)得其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法操作，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 相似度評(píng)價(jià) 采用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A)”比較10份樣品的色譜圖和計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，設(shè)置S1為參照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行全峰匹配，得到對(duì)照?qǐng)D譜(R)，取平均數(shù)計(jì)算的方法得出。其相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。各藥材與對(duì)照特征圖譜的差異較小，藥材質(zhì)量較穩(wěn)定。

2.5 參照峰的選擇 在“2.1”色譜條件下，分別測(cè)定來(lái)源于內(nèi)蒙古、吉林等地收集的藍(lán)盆花樣品的UHPLC特征圖譜(圖 1)，共確定22個(gè)共有特征峰(圖2)，其中木犀草苷的色譜峰分離度良好，峰面積較大且為所有峰共有，所以確定木犀草苷峰為參照峰。以木犀草苷的峰面積作為參照標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各共有峰的相對(duì)峰面積及RSD值(表3 )。

圖1 10批藍(lán)盆花藥材的UHPLC特征圖譜

圖2 藍(lán)盆花藥材特征圖譜共有峰編號(hào)(10號(hào)峰為參照峰木犀草苷)

2.6 主要色譜峰的鑒別 經(jīng)查閱文獻(xiàn)，藍(lán)盆花藥材中主要含有藍(lán)盆花主要成分包括黃酮類(lèi)化合物，環(huán)烯醚萜類(lèi)，香豆素類(lèi)，三萜類(lèi)，有機(jī)酸等活性成分。本研究采用UHPLC- Q-Tof-MS/MS技術(shù)，采用負(fù)離子模式掃描，并根據(jù)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及其質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行定性分析，結(jié)果22個(gè)共有峰中共鑒別出 10個(gè)色譜峰。見(jiàn)表4。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了多種流動(dòng)相系統(tǒng)：(1)甲醇-水梯度洗脫；(2)甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脫；(3)乙腈-0.1%冰醋酸梯度洗脫；(4)乙腈-0.3%磷酸梯度洗脫。結(jié)果表明在酸性環(huán)境下有利于各色譜峰的分離，且乙腈的洗脫能力強(qiáng)，分離度好，基線平穩(wěn)。

表2 10批樣品的相似度

表3 各共有特征峰相對(duì)峰面積及RSD值

表4 藍(lán)盆花藥材共有色譜峰定性分析

3.2 藍(lán)盆花指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 本文采用了超高效液相色譜UHPLC建立藍(lán)盆花指紋圖譜，耗時(shí)更少，特征峰更多。采用液質(zhì)聯(lián)用的方法，鑒別22個(gè)共有峰中的10主要成分，這些成分可以作為藍(lán)盆花藥材的指標(biāo)性成分。藍(lán)盆花不同批次的藥材相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，10批供試品的UHPLC指紋圖譜相似度均大于0.99。其中S1，S2，S4，S5，S6樣品的相似度處于0.990以上，各共有峰保留時(shí)間穩(wěn)定，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的方法所建立的指紋圖譜精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性可靠，可以作為控制藍(lán)盆花藥材質(zhì)量的依據(jù)之一。