二甲雙胍介導(dǎo)的增強(qiáng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)與增加的腫瘤灌注的相關(guān)性

王吉昌，李雄雄，李光月

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1. 血管外科；2. 乳腺外科；3. 科技部，陜西西安 710061)

CD8陽(yáng)性T細(xì)胞是人體T淋巴細(xì)胞群中非常重要的一群細(xì)胞，在介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫中發(fā)揮極其重要的作用。目前，在眾多腫瘤治療的研究方向中，以增強(qiáng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫療法被認(rèn)為是一種可能治愈腫瘤的方法。而抗腫瘤免疫中，只有當(dāng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部才可能通過(guò)接觸性殺傷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，CD8陽(yáng)性T細(xì)胞向包括腫瘤在內(nèi)的組織內(nèi)浸潤(rùn)的程度與腫瘤的灌注情況存在密切關(guān)系。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，抗代謝異常藥物二甲雙胍可增加惡性腫瘤內(nèi)部的血液灌注，從而抑制腫瘤的嚴(yán)重缺氧。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以增加CD8陽(yáng)性T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)數(shù)量。而關(guān)于二甲雙胍介導(dǎo)的增強(qiáng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)與增加的腫瘤灌注是否有關(guān)，目前仍不十分清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)原位小鼠4T1乳腺癌中CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量、腫瘤灌注情況及兩者間的相關(guān)性，探討二甲雙胍介導(dǎo)的增加腫瘤灌注與增強(qiáng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、動(dòng)物及試劑6～8周雌性BALB/C小鼠20只，體質(zhì)量16～20 g，全部由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。兔抗小鼠CD8抗體購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TRITC標(biāo)記的Lectin由Vector Labs公司提供；Fitc標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Invitrogen公司；Dapi核復(fù)染試劑購(gòu)自Sigma公司；40 g/L多聚甲醛及PBS購(gòu)自西安壯志生物有限公司；胎牛血清蛋白及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；實(shí)驗(yàn)用二甲雙胍粉劑及Triton X-100購(gòu)自Sigma公司；4T1小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；OCT冰凍標(biāo)本包埋劑購(gòu)自日本櫻花公司。

1.2細(xì)胞準(zhǔn)備4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞使用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。并連續(xù)傳代3代后行分皿培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合接近80%～90%時(shí)，用PBS充分沖洗后，胰蛋白酶消化細(xì)胞。鏡下觀察視野內(nèi)多數(shù)細(xì)胞變圓并開始脫離培養(yǎng)皿底板時(shí)，終止消化。離心后棄去上清，并使用PBS沖洗后再次清洗后離心。棄去PBS上清后使用不含胎牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將懸液中細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/mL，置于冰上備用。

1.3原位乳腺癌模型構(gòu)建及動(dòng)物分組原位接種細(xì)胞前用移液器充分重懸細(xì)胞。用胰島素針穿刺BALB/C小鼠的第四對(duì)乳腺的脂肪墊，并注射細(xì)胞懸液100 μL。接種后第9天平均腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)，將20只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和二甲雙胍組。對(duì)照組小鼠給予普通飲用水，干預(yù)組小鼠給予含有二甲雙胍的飲用水。小鼠平均飲水量為3 mL/d。二甲雙胍干預(yù)劑量為250 mg/kg。

1.4血管灌注實(shí)驗(yàn)及標(biāo)本準(zhǔn)備連續(xù)干預(yù)2周后，使用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠。后經(jīng)尾靜脈注射TRITC-Lectin共約100 μL。15 min后過(guò)量注射戊巴比妥鈉處死小鼠后，經(jīng)心臟灌注40 g/L多聚甲醛約50 mL，完整提取腫瘤組織，并于40 g/L多聚甲醛中避光固定約4 h。后使用200～300 g/L蔗糖溶液對(duì)標(biāo)本行避光脫水后吸干，并使用OCT包埋劑包埋標(biāo)本，后置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｓ?22 ℃下進(jìn)行切片，厚度約6 μm，于-80 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5免疫熒光染色冰凍切片經(jīng)PBS清洗和2 mL/L Triton X-100溶液透膜，再次清洗后用50 g/L BSA于37 ℃下封閉切片30 min。甩掉BSA后滴加CD8抗體(工作液稀釋比為1∶90)，于4 ℃下孵育過(guò)夜后，PBS清洗并滴加Fitc標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育1 h，清洗并復(fù)染Dapi。充分清洗切片后，使用蓋玻片及抗熒光淬滅劑封片。避光37 ℃下烘干1 h，Leica共聚焦熒光顯微鏡下記錄染色結(jié)果。

1.6CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)程度及灌注程度測(cè)定熒光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察10個(gè)視野(同時(shí)記錄紅色信號(hào)的灌注圖像)，記錄每個(gè)視野中的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞(綠色熒光)的數(shù)量，并取平均值作為每一個(gè)標(biāo)本的平均CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量，并換算計(jì)量為數(shù)量/mm2。灌注情況的測(cè)定：首先取與測(cè)量CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量視野相對(duì)應(yīng)的紅色熒光信號(hào)視野。使用ImageJ軟件測(cè)量紅色Lectin陽(yáng)性信號(hào)的面積，10個(gè)視野的平均值作為每個(gè)標(biāo)本的Lectin陽(yáng)性信號(hào)面積(即腫瘤血管的灌注面積)，并最終換算為μm2的計(jì)量形式。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graphpad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較計(jì)量資料之前，行Levene方差齊性檢驗(yàn)。兩組間的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。每一標(biāo)本的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及相應(yīng)的Lectin陽(yáng)性信號(hào)面積用于進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Spearman Correlation方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍增加CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量對(duì)照組和二甲雙胍干預(yù)組腫瘤組織內(nèi)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞(綠色信號(hào))數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.707，P<0.001)。兩組結(jié)果的Levene方差齊性檢驗(yàn)P>0.05，提示方差齊。結(jié)果分析顯示，二甲雙胍干預(yù)組小鼠4T1乳腺癌腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)量[(120.8±26.9)個(gè)/mm2]顯著高于對(duì)照組[(67.9±22.9)個(gè)/mm2](圖1、圖2，表1)，這提示持續(xù)二甲雙胍干預(yù)明顯增加了小鼠乳腺癌中的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量。

圖1對(duì)照組4T1腫瘤內(nèi)部?jī)H可見少量浸潤(rùn)C(jī)D8陽(yáng)性T細(xì)胞及Lectin灌注區(qū)域

Fig.1 Only a small number of CD8+T cells and lectin-perfused area were found in the untreated 4T1 cancer

綠色熒光：CD8抗體染色；紅色信號(hào)：預(yù)先經(jīng)心臟灌注的Lectin；藍(lán)色：Dapi核染色。標(biāo)尺：100 μm。

2.2二甲雙胍可增加4T1腫瘤灌注對(duì)照組及二甲雙胍干預(yù)組4T1腫瘤內(nèi)部的Lectin陽(yáng)性信號(hào)面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.494，P=0.003)。兩組數(shù)據(jù)方差齊性(Levene檢驗(yàn)P>0.05)。二甲雙胍干預(yù)組4T1腫瘤內(nèi)的Lectin陽(yáng)性面積[(18 357.0±5 865.0)像素/μm2]顯著高于對(duì)照組[(10 233.0±4 434.0)像素/μm2](圖1、圖2，表1)。這提示二甲雙胍可增強(qiáng)腫瘤血液灌注。

圖2二甲雙胍組增加4T1腫瘤內(nèi)部的Lectin灌注區(qū)域及浸潤(rùn)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)量

Fig.2 Metformin administration increased lectin-perfused area and the infiltrated CD8+T cells inside 4T1 cancer

白色箭頭：伴隨血流灌注進(jìn)入腫瘤內(nèi)部的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞；綠色熒光：CD8抗體染色；紅色信號(hào)：預(yù)先經(jīng)心臟灌注的Lectin；藍(lán)色：Dapi核染色。標(biāo)尺：100 μm。

表1各組4T1腫瘤內(nèi)部CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及被Lectin灌注的信號(hào)面積

Tab.1 Number of CD8+T cells infiltrated in the 4T1 cancer and lectin-perfused tumor area in each group

參數(shù)對(duì)照組二甲雙胍干預(yù)組tPCD8+ T cells(n/mm2)67.9±22.9120.8±26.94.50.001Lectin+信號(hào)(μm2)10233.0±4434.018357.0±5865.03.50.003

2.3CD8陽(yáng)性T細(xì)胞通過(guò)血流進(jìn)入腫瘤內(nèi)部二甲雙胍干預(yù)組的4T1腫瘤中，觀察顯示有3個(gè)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞與紅色Lectin信號(hào)共定位；其中有1個(gè)細(xì)胞的一側(cè)已經(jīng)突出Lectin信號(hào)的邊界以外，提示該細(xì)胞可能正在從灌注血管內(nèi)向腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)發(fā)生遷移(圖2)。這提示外周血中的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞可通過(guò)血流灌注進(jìn)入腫瘤內(nèi)部并最終進(jìn)入腫瘤實(shí)質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮殺傷作用。

2.4腫瘤灌注面積與CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量呈線性相關(guān)對(duì)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及Lectin灌注面積進(jìn)行Spearman Correlation分析。兩組的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與Lectin灌注面積均呈線性相關(guān)(圖3)。二甲雙胍干預(yù)組的相關(guān)系數(shù)R為0.884，P=0.007；非干預(yù)組的相關(guān)系數(shù)R為0.928，P<0.001(圖3)。

3 討 論

二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的傳統(tǒng)藥物，其良好的耐受性及低毒性一度使其成為首選治療[1]。隨著研究的不斷深入，科學(xué)家們?cè)谂R床前實(shí)驗(yàn)研究中逐漸發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外，基于人群的數(shù)據(jù)研究證實(shí)：服用二甲雙胍的糖尿病患者多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生率低于未服用組患者[2]。

圖34T1腫瘤內(nèi)部的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與Lectin灌注面積呈線性相關(guān)

Fig.3 The number of CD8+T cells infiltrated in the 4T1 cancer was linearly correlated with lectin-perfused area

A：對(duì)照組；B：二甲雙胍干預(yù)組。SpearmanR為相關(guān)系數(shù)。

但是，有關(guān)二甲雙胍發(fā)揮抗腫瘤的具體作用仍不十分清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建原位小鼠乳腺癌模型并用二甲雙胍持續(xù)干預(yù)2周，發(fā)現(xiàn)可增加腫瘤的灌注水平及腫瘤內(nèi)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。大量研究數(shù)據(jù)已證實(shí)，腫瘤內(nèi)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量與患者的預(yù)后密切相關(guān)[3]。因此，本研究結(jié)果對(duì)目前仍不十分清楚的二甲雙胍抗腫瘤機(jī)制是一個(gè)重要補(bǔ)充。

本課題組前期研究中已發(fā)現(xiàn)：小劑量二甲雙胍[<100 mg/(kg·d)]僅僅產(chǎn)生輕微的抗腫瘤作用。由于CD8陽(yáng)性細(xì)胞的主要作用在于直接殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，本研究不適合用小劑量進(jìn)行干預(yù)觀察，而所使用的劑量[250 mg/(kg·d)]是根據(jù)物種藥物劑量換算公式(根據(jù)體表面積)換算所得。該劑量與臨床劑量相匹配，從而能更好用于闡明二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制，并使研究結(jié)果更具外推性。

CD8陽(yáng)性T細(xì)胞是機(jī)體對(duì)抗腫瘤進(jìn)展的一種重要因素[4]。CD8陽(yáng)性T細(xì)胞主要通過(guò)接觸性殺傷對(duì)腫瘤發(fā)揮作用，因此，腫瘤組織內(nèi)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量對(duì)于機(jī)體抗腫瘤作用至關(guān)重要。近來(lái)有研究證實(shí)：二甲雙胍可通過(guò)增加腫瘤內(nèi)的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量而發(fā)揮抗腫瘤作用[5-6]。本研究再次證實(shí)上述結(jié)果，并且進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，增加的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量與增加的腫瘤灌注之間存在密切相關(guān)性。事實(shí)上，在機(jī)體處于免疫激活狀態(tài)時(shí)，比如在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，大量T細(xì)胞在胸腺中成熟后進(jìn)入血液，并隨血流進(jìn)入病灶從而發(fā)揮免疫作用[7]。因此，在二甲雙胍干預(yù)下產(chǎn)生的腫瘤灌注的改善可使更多的外周CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部。

本研究發(fā)現(xiàn)的二甲雙胍增加腫瘤血流灌注可能具有更重要的意義。目前比較認(rèn)可的觀點(diǎn)是腫瘤在早期生長(zhǎng)時(shí)就出現(xiàn)缺氧[8-9]。缺氧可以通過(guò)抑制腫瘤免疫、介導(dǎo)放化療抵抗的機(jī)制以進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[10]。因此，二甲雙胍通過(guò)增加腫瘤灌注帶來(lái)的治療意義不應(yīng)該僅僅被局限于增加CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)。

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抑制腫瘤異常血管生成的作用[11]。而對(duì)于二甲雙胍是否對(duì)腫瘤血管的功能和結(jié)構(gòu)狀態(tài)產(chǎn)生影響則未進(jìn)行深入報(bào)道。本研究的結(jié)果至少說(shuō)明二甲雙胍具有增強(qiáng)腫瘤血管功能狀態(tài)的作用。據(jù)報(bào)道，血管功能與血管的成熟度密切相關(guān)，即與血管內(nèi)皮層被血管平滑肌細(xì)胞包被的程度有關(guān)[12-13]。而且課題組新近發(fā)表的文章已經(jīng)證實(shí)，二甲雙胍具有改善腫瘤血管成熟度的作用[14]，這也提示是血管功能得到改善的原因。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，二甲雙胍介導(dǎo)的增強(qiáng)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)的作用與其產(chǎn)生的改善腫瘤灌注的作用密切相關(guān)。