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    醬香酒生產(chǎn)過(guò)程中的微生物研究

    2018-10-30 14:33:30羅小葉王曉丹邱樹(shù)毅
    釀酒科技 2018年10期
    關(guān)鍵詞:醬香型醬香大曲

    羅小葉 ,王曉丹 ,邱樹(shù)毅

    (1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng)550025; 2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025)

    我國(guó)傳統(tǒng)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一,其主要以富含淀粉質(zhì)的糧食為原料,經(jīng)過(guò)固態(tài)、半固態(tài)及液態(tài)等方式發(fā)酵、蒸餾而成。醬香型白酒是中國(guó)蒸餾酒的重要香型之一,它采用獨(dú)特的釀造工藝,高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和長(zhǎng)期貯存,此外,其釀造工藝還包括2次投料、9次蒸煮、8次發(fā)酵、7次取酒,長(zhǎng)時(shí)間分輪次、分香型貯存后,精心勾調(diào)而成[1]。茅臺(tái)酒是醬香型白酒的典型代表,是世界三大(蒸餾)名酒之一,以其香氣幽雅、酒體醇厚豐滿、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久的特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者的青睞,是中國(guó)優(yōu)質(zhì)白酒的典范。

    微生物的種類及數(shù)量對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味有著特殊的關(guān)系,直接參與了醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成。本文介紹了本課題組對(duì)醬香型白酒從制曲、堆積到窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中各類微生物的研究情況,通過(guò)免培養(yǎng)和可培養(yǎng)的方法對(duì)整個(gè)釀造過(guò)程各類微生物的菌群結(jié)構(gòu)及主要功能菌進(jìn)行分析,從多角度認(rèn)識(shí)醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的各類微生物,對(duì)揭示醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理及提高白酒質(zhì)量有一定的借鑒,亦對(duì)控制醬香型白酒生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和規(guī)范性具有指導(dǎo)意義。

    1 醬香酒中的細(xì)菌研究

    細(xì)菌作為醬香白酒主要微生物類群之一,在整個(gè)釀造過(guò)程中呈現(xiàn)出種類與功能多樣性的特點(diǎn),是發(fā)酵生香的動(dòng)力來(lái)源,細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)特征直接影響著代謝產(chǎn)物的形成,多年來(lái)針對(duì)細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)的分析一直是研究熱點(diǎn)。

    1.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

    王曉丹等[2]研究了茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品細(xì)菌種群進(jìn)行分析,得到的在各分類水平上的物種組成比例以及群落結(jié)構(gòu)的情況見(jiàn)表1。

    表1 醬香大曲細(xì)菌類群分析

    研究表明,細(xì)菌類群分析平均92%以上的序列可以注釋在科水平,有70%的序列可以注釋到屬的水平,確定醬香大曲細(xì)菌的組成以厚壁菌門(mén)(87.3%~91.8%)為主要類群,并發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過(guò)的藍(lán)細(xì)菌門(mén)(0.1%~1.5%),其中芽孢桿菌屬占細(xì)菌總量的60%以上,在醬香大曲細(xì)菌類群分析中屬優(yōu)勢(shì)種類。

    1.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    肖蓓[3]、王婧[4]采用可培養(yǎng)稀釋平板法分析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲細(xì)菌群落組成,從大曲樣品中共分離出47株細(xì)菌,鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 醬香大曲細(xì)菌種類

    其中,地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在大曲中的含量都比其他細(xì)菌多,是典型的嗜熱芽孢桿菌,也是大曲中產(chǎn)醬香功能細(xì)菌,初步推測(cè)為地域性微生物類群。

    肖蓓[3]對(duì)大曲樣品中分離純化篩選出的上述可培養(yǎng)細(xì)菌,進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,篩選出的可培養(yǎng)細(xì)菌可產(chǎn)生酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶及脂肪酶,不同種類的細(xì)菌產(chǎn)酶種類及酶活大小差異較大。結(jié)果見(jiàn)表3。

    其次王婧[4]對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵并采用GC-MS聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,結(jié)果如表4所示,表明各株細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物豐富,其中四甲基吡嗪和香味物質(zhì)乙偶姻含量較高。并從中篩選出產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)相對(duì)較高的地衣芽孢桿菌,應(yīng)用到麩曲醬香型白酒生產(chǎn)中,并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件,提高麩曲醬香型白酒酒質(zhì),增加了醬香風(fēng)味。

    1.3 可培養(yǎng)方法分析醬香酒釀造過(guò)程細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    張小龍[5]以貴州遵義某釀酒有限公司提供酒醅為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)平板劃線的方法從酒醅中細(xì)菌進(jìn)行分離篩選,經(jīng)鑒定主要為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌等種類。

    篩選到的細(xì)菌通過(guò)模擬固態(tài)發(fā)酵并利用GCMS聯(lián)用儀分析產(chǎn)醬香濃郁的細(xì)菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物,結(jié)果見(jiàn)表5,表明產(chǎn)物中芳香族及雜環(huán)類化合物含量較高,其中四甲基吡嗪含量最高,這賦予醬香型白酒以濃郁突出的醬香風(fēng)味。

    表3 細(xì)菌5種酶酶活測(cè)定結(jié)果 (U/mL)

    表4 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

    表5 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

    1.4 醬香酒中嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    酒醅微生物區(qū)系是白酒釀造體系中微生物多樣性研究的重點(diǎn),其產(chǎn)生的酶類、酯類、酸類是構(gòu)成酒體風(fēng)味物質(zhì)的前提。而厭氧培養(yǎng)由于技術(shù)繁瑣,耗費(fèi)財(cái)力而成為厭氧微生物研究的瓶頸,所以目前關(guān)于醬香白酒釀造過(guò)程中厭氧細(xì)菌的報(bào)道很少。曾超[6]采用較簡(jiǎn)單便捷的厭氧手套箱法來(lái)對(duì)釀造酒醅中厭氧細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),結(jié)果在厭氧工作站中,利用平板劃線法對(duì)各輪次酒醅進(jìn)行分離篩選,從酒醅中分離出7株嚴(yán)格厭氧菌,經(jīng)鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridium xylanolyticum)、煎盤(pán)梭菌(Clostridium sartagoformum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、近端梭菌(Clostridium clostridiiforme)。此外通過(guò)對(duì)嚴(yán)格厭氧菌進(jìn)行模擬固態(tài)發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)木聚糖梭菌、煎盤(pán)梭菌2株嚴(yán)格厭氧菌具有很強(qiáng)的醬香氣味,通過(guò)GC-MS聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,其中含量較高的吡嗪類化合物是產(chǎn)生醬香味的主要物質(zhì)。課題組通過(guò)對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中厭氧菌的研究為今后深入探討其功能提供一定基礎(chǔ)。

    2 醬香酒中的高溫放線菌與放線菌

    2.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結(jié)構(gòu)

    高溫放線菌分類地位屬于細(xì)菌域(Domain Bacteria)、厚壁菌門(mén)(Phylum Firmicutes)、芽孢桿菌綱(Class Bacilli)、芽孢桿菌目(Order Bacillales)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)[7]。王曉丹[8]采用第二代高通量測(cè)序的方法對(duì)醬香大曲細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了分析,同時(shí)發(fā)現(xiàn)高溫放線菌的平均相對(duì)含量占34.40%,且不同企業(yè)大曲樣品的高溫放線菌含量有差異(表6)。采用免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬同為醬香型大曲主要優(yōu)勢(shì)菌群,推測(cè)高溫放線菌在醬香型大曲中同樣扮演了重要的角色。

    表6 不同企業(yè)醬香大曲高溫方放線菌與芽孢桿菌科含量對(duì)比 (%)

    2.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    李豆南[9]、羅小葉[10]從茅臺(tái)鎮(zhèn)某醬香酒企業(yè)成品曲中采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對(duì)樣品中高溫放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng),結(jié)果從中分離鑒定出5株高溫放線菌,分別為:嗜溫高溫放線菌(Thermoactinomyces thalpohillus)、甘蔗高溫放線菌(Thermoactinomyces sacchari)、甘蔗萊斯氏菌(Laceyella sacchari)。模擬固態(tài)發(fā)酵和分析揮發(fā)性成分,結(jié)果顯示,揮發(fā)性成分組成主要以醇類、醛類、酮類、烷烴類、酯類、萜烯類物質(zhì)為主,其在感官品評(píng)方面表現(xiàn)出醬味和土霉異味,揮發(fā)性產(chǎn)物檢測(cè)到的表現(xiàn)醬味的吡嗪類物質(zhì)及表現(xiàn)出土霉異味的二甲萘烷醇。上述研究對(duì)了解這一種屬在醬香大曲中的作用是非常必要的,也填補(bǔ)了高溫放線菌分離篩選及其功能研究的空白。

    2.3 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結(jié)構(gòu)

    王曉丹[2]采用高通量測(cè)序的方法對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究,分析結(jié)果表明,檢測(cè)到放線菌門(mén)的微生物占一定比例,主要為纖維素單胞菌科、分支桿菌科、諾卡菌科、鏈霉菌科、微球菌科、高溫單孢菌科、丙酸桿菌科、短桿菌科、多孢放線菌科等科的放線菌,其中糖多孢菌屬的平均相對(duì)含量最高,為9.2%。

    2.4 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    對(duì)于傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)領(lǐng)域有關(guān)放線菌研究,主要集中在白酒發(fā)酵過(guò)程中酒醅、窖泥、發(fā)酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定,羅小葉等探究醬香酒大曲中放線菌資源及功能,從中分離鑒定出了3株放線菌分別為可可鏈霉菌(Streptomyces cacaoi)、沙阿霉素鏈霉菌(Streptomyces zaomyceticus),同時(shí)對(duì)其產(chǎn)酶產(chǎn)香特性進(jìn)行相關(guān)研究,見(jiàn)表7。結(jié)果表明,3株菌產(chǎn)果膠酶較為突出,固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分分析見(jiàn)圖1。主要以酯類物質(zhì)為主,且均能產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。

    表7 放線菌5種酶酶活力測(cè)定結(jié)果 (U/g)

    圖1 醬香大曲中鏈霉菌揮發(fā)性成分分析

    3 醬香酒中的酵母菌

    酵母是白酒釀造微生物家族中不可或缺的一類微生物,從醬香型白酒制曲到釀造過(guò)程一直可以檢測(cè)出,直接關(guān)系到產(chǎn)酒率,且能夠代謝產(chǎn)生大量不同的風(fēng)味物質(zhì),對(duì)醬香型白酒風(fēng)格的形成具有重要作用。對(duì)醬香型白酒大曲和釀造過(guò)程中的酵母進(jìn)行研究,揭示釀造工藝中酵母消長(zhǎng)規(guī)律及群落結(jié)構(gòu),認(rèn)識(shí)微生態(tài)環(huán)境中酵母作用及其與微生態(tài)環(huán)境中各種微生物之間的代謝關(guān)系,能進(jìn)一步發(fā)揮酵母資源在白酒生產(chǎn)中的作用,提高酵母生物經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值,也為深入研究醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理及呈香機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù),并對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義[11]。

    3.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)

    王曉丹[2]采用高通量測(cè)序的方法對(duì)茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究,分析檢測(cè)到子囊菌門(mén)、酵母綱、酵母目下的酵母菌,如表8所示,其中畢赤酵母屬和復(fù)膜孢酵母屬的酵母種類平均相對(duì)含量最高,此外各個(gè)企業(yè)的酵母菌群結(jié)構(gòu)及含量均有一定差異。

    3.2 可培養(yǎng)方法分析醬香白酒釀造過(guò)程酵母菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    醬香型白酒高溫制曲工藝雖然會(huì)限制酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖,但是仍然有部分酵母可能處于存活或者休眠狀態(tài),并且成品曲出房后及貯存過(guò)程中,在常溫條件下繼續(xù)網(wǎng)羅周?chē)h(huán)境中的酵母,因而醬香型白酒高溫大曲中仍含有一定數(shù)量的酵母[11]。課題組孔維兵[12]、陳美竹[13]、龐博[14]采用可培養(yǎng)方法對(duì)醬香型白酒釀造過(guò)程中的酵母菌進(jìn)行分離篩選和功能特性研究,結(jié)果見(jiàn)表9。

    表8 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲酵母菌菌群結(jié)構(gòu)

    表9 可培養(yǎng)方法分析酵母菌菌群結(jié)構(gòu)及特性

    4 醬香酒中的絲狀真菌

    醬香型白酒獨(dú)特的釀造工藝形成了獨(dú)特的微生物群落,其中霉菌是醬香大曲中一類比較重要的微生物,種類豐富,能夠分泌多種酶類和代謝產(chǎn)物,對(duì)醬香型白酒獨(dú)特的同步糖化發(fā)酵釀造方式和風(fēng)味物質(zhì)的形成有重要影響。

    4.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結(jié)構(gòu)

    王曉丹[2]通過(guò)高通量測(cè)序分析茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香白酒7個(gè)企業(yè)大曲樣品霉菌種群結(jié)構(gòu),分析結(jié)果如表10所示,大曲樣品中曲霉屬、根霉屬及橫梗霉屬3個(gè)屬的霉菌相對(duì)含量明顯高于其他屬類,此外不同企業(yè)的霉菌在種類及數(shù)量上有一定差異。

    4.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結(jié)構(gòu)及功能特性

    表10 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲霉菌菌群結(jié)構(gòu)

    表11 可培養(yǎng)方法分析霉菌菌群結(jié)構(gòu)及特性

    班世棟[15]、徐佳[16]對(duì)貴州某醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)醬香型大曲中霉菌進(jìn)行研究,分別研究白曲、黃曲和黑曲不同儲(chǔ)藏時(shí)間的大曲霉菌的數(shù)量變化、可培養(yǎng)霉菌的種類及產(chǎn)酶情況。結(jié)果表明,大曲在儲(chǔ)藏過(guò)程中,白曲的霉菌數(shù)量最多,黃曲和黑曲的數(shù)量相差較小,總共分離到28株霉菌,見(jiàn)表11。通過(guò)研究醬香大曲的霉菌種類及數(shù)量,結(jié)合可培養(yǎng)霉菌的酶活體系,為衡量大曲品質(zhì),完善制曲工藝的操作控制生產(chǎn)高品質(zhì)大曲提供參考依據(jù),也為強(qiáng)化大曲提供研究基礎(chǔ)。

    5 展望

    醬香白酒作為中國(guó)白酒重要香型,擁有獨(dú)特的生產(chǎn)工藝和別具一格的風(fēng)味,以及獨(dú)特的魅力,對(duì)醬香白酒的研究也具有很高的理論價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。

    采用可培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)技術(shù)來(lái)分析醬香白酒整個(gè)釀造過(guò)程的微生物菌群結(jié)構(gòu),從物種分類水平上詳細(xì)描述了醬香白酒釀造過(guò)程各類微生物群落的特征性結(jié)構(gòu),每個(gè)企業(yè)的微生物類群組成都具有各自的特點(diǎn),根據(jù)微生物類群組成分離篩選特征微生物和功能微生物,為今后醬香白酒微生物多樣性及功能性的深入研究提供了新的思路。隨著對(duì)醬香白酒相關(guān)研究的增多,積累了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),醬香白酒的研究在不斷向前發(fā)展。

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