表沒食子兒茶素沒食子酸酯體內(nèi)外調(diào)節(jié)大鼠膽固醇代謝的機制

葛 建，林 芳，張永勇，鄧同樂，胡華軍，劉 軍

（中國計量大學生命科學學院，浙江 杭州 310018）

植物多酚是多羥基酚類化合物的總稱，是廣泛存在于植物體內(nèi)的植物次生代謝物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血脂、清除自由基、降血糖等一系列重要的藥理功能[1]。茶多酚為茶葉中含量最多的一類活性成分，約占茶葉干質(zhì)量的20%，而其中又以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）含量最高，約占兒茶素總量的50%～60%[2]。

關于EGCG調(diào)控脂質(zhì)代謝機制方面的研究，國內(nèi)外學者從不同角度對非華人分別進行了探索。Kobayashi[3]、Raederstorff[4]和Wu[5]等分別從EGCG影響胃腸道中膽固醇微粒溶解性、抑制食物中脂質(zhì)成分吸收以及EGCG與低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）結合角度探索了EGCG對膽固醇代謝的調(diào)控機理。王瑋[6]、劉智偉[7]等分別從綠茶多酚（主要成分為EGCG）對腸道雙歧桿菌和人源化小鼠腸道菌群影響的角度探討了綠茶多酚對機體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)機制。本課題組前期從EGCG對膽汁酸體外吸附角度探索了其降血脂活性[8]，但是相關機制未進一步闡明。由于大劑量腹腔注射EGCG能夠?qū)е赂螕p傷[9]，本研究以人結腸癌細胞（Caco-2）模型和動物灌胃途徑，從體外膽汁酸重吸收和膽固醇攝取以及體內(nèi)相關基因表達角度，探索EGCG調(diào)控血脂的機制。

機體內(nèi)膽酸鹽是膽固醇的主要去路，EGCG通過與膽汁酸吸附，阻止膽酸鹽的重吸收，促使肝臟中的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而達到降血脂的目的[10]。Kahlon等于2004—2007年持續(xù)開展了不同水果、蔬菜在體外吸附膽酸鹽能力的研究[11-13]。胡凱[14]、鄧雪[15]等探討了不同茶葉粉末、茶葉水提液以及茶多酚等對膽酸鹽的結合能力。但是此類研究只是從體外膽汁酸吸附的角度來探索調(diào)血脂機制，而關于EGCG通過干預膽汁酸重吸收和膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)控脂質(zhì)代謝機制的研究還鮮見報道。因此，本研究在前期研究基礎上開展深入探索，從而探討EGCG對膽固醇代謝的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量（181±10）g，購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）20140001，于杭州師范大學實驗動物中心飼養(yǎng)。

EGCG（純度98%以上） 杭州和田生物技術有限公司；?；悄懰徕c（sodium taurocholic，STC）、甘氨膽酸鈉（sodium glycocholate，SGC）標準品（純度98%以上） 杭州邦易化工有限公司；甲醇、乙腈（色譜純） 杭州米克化工有限公司；Caco-2細胞、大鼠肝細胞（BRL） 中國科學院上海細胞典藏委員會；高糖DMEM細胞培養(yǎng)液（含1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%雙抗和10%胎牛血清） ?？寺∩锘瘜W制品（北京）有限公司；熒光標記膽固醇（NBD-膽固醇） 阿拉?。ㄉ虾＃┥镌噭┯邢薰?；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒 上海生工生物工程有限公司；包埋石蠟 德國徠卡公司；BCA定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒、LDL膽固醇（LDL-cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒 南京建成生物工程研究所；化學發(fā)光顯色（electro-chemi-luminescence，ECL）試劑盒 美國GE公司。

1.2 儀器與設備

LC-20ATvp高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；細胞培養(yǎng)箱 德國Binder公司；Trans-well小室 美國Corning公司；MK-3臺式熒光檢測儀 荷蘭雷勃生物醫(yī)學有限公司；倒置顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 EGCG對SGC和STC在Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運中的影響

1.3.1.1 標準曲線的繪制

根據(jù)文獻[16]略作修改，本實驗采用空白HBSS（Hank’s balanced salt solution）緩沖液分別配制濃度為0.05～1.20 mmol/L的SGC和STC的混合溶液。將不同濃度的STC和SGC采用高效液相色譜檢測，相應標準曲線方程分別為Y＝380 726X+803和Y＝630 372X-1 171。STC與SGC的峰面積與濃度之間的線性相關系數(shù)分別為0.999 7、0.999 8，說明線性關系良好。日內(nèi)和日間相對標準偏差均低于10%，說明精密度較好。

1.3.1.2 Caco-2細胞的培養(yǎng)

Caco-2細胞于充有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長勢良好，取出無菌Trans-well小室（聚碳酸酯膜，孔徑0.4 μm）置于6 孔培養(yǎng)板的中間部位并做好標記。取出細胞，加適量消化液，倒置生物顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，加適量新鮮培養(yǎng)基，用滅菌后的膠頭滴管吹打培養(yǎng)瓶，將細胞吹打至培養(yǎng)基中，混勻，調(diào)整密度為1×105個/mL。

每個小室細胞單層膜頂端（apical side，AP）側(cè)加1.5 mL細胞懸液，基底端（basolateral side，BL）側(cè)加2.5 mL空白培養(yǎng)液，十字晃動后放入培養(yǎng)箱中。隔一天換液1 次，1 周后每天更換培養(yǎng)液，21 d后待細胞基本匯合，檢測其電阻值、苯酚紅滲漏性以及小室AP和BL側(cè)堿性磷酸酶活力，以此判斷Caco-2單層細胞完整性、苯酚紅滲透率以及細胞極性[16]。

1.3.1.3 樣品收集和檢測

取跨膜電阻值200 Ω/cm2以上、苯酚紅滲透率10%以上以及AP側(cè)堿性磷酸酶活性10 倍于BL側(cè)的Trans-well小室細胞模型，實驗前用預熱的HBSS緩沖液清洗細胞3 次，最后1 次于培養(yǎng)箱中孵育0.5 h，輕輕吸去緩沖液，洗去Caco-2細胞表面雜質(zhì)。重吸收實驗設立3 組，分別為空白對照組（只加空白HBSS緩沖液）、膽酸鹽+HBSS組（加入用HBSS緩沖液稀釋的膽酸鹽溶液）和膽酸鹽+EGCG組（加入膽酸鹽溶液和EGCG溶液混合液）。將EGCG用HBSS緩沖液配成2 mg/mL的溶液；用HBSS緩沖液配制2 種含膽酸鹽的混合溶液，濃度分別為5.0 mmol/L和0.5 mmol/L。按體積比1∶1將上述EGCG溶液和膽酸鹽溶液混合，使最終EGCG質(zhì)量濃度為1 mg/mL、膽酸鹽濃度分別為2.5 mmol/L和0.25 mmol/L。分別吸取1.5 mL HBSS緩沖液/膽酸鹽混合液/EGCG+膽酸鹽混合液加入AP側(cè)作為供給側(cè)，同時BL側(cè)加入2.5 mL HBSS緩沖液作為受體側(cè)。將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、50 r/min的恒溫振蕩器中孵育。分別于0、2、4 h和8 h吸取BL側(cè)100 μL溶液于已標記離心管中，同時補充相同體積的HBSS緩沖液。按照1.3.1.1節(jié)方法利用高效液相色譜分析，將所得膽酸鹽峰面積代入相應標準曲線方程，得出培養(yǎng)液中膽酸鹽濃度，以培養(yǎng)液中膽酸鹽濃度乘以培養(yǎng)液體積計算不同時間內(nèi)膽酸鹽的滲透量。

1.3.2 EGCG對膽固醇在細胞內(nèi)攝取和外排的影響

根據(jù)文獻[17-18]的方法略有修改，將1×105個/mL的Caco-2細胞和BRL細胞懸液3 mL分別加入相應6 孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用濃度為0、40 μmol/L的EGCG的10%胎牛血清培養(yǎng)液干預24 h后換液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后用10%胎牛血清培養(yǎng)液（含5 μmol/L NBD-膽固醇）孵育4 h，再用含濃度為0、40 μmol/L的EGCG的10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。孵育結束后，用PBS清洗3 遍，然后用0.1% Triton X-100裂解細胞，吸取200 μL細胞裂解液于黑色酶標板中，采用熒光酶標儀在激發(fā)波長469 nm、發(fā)射波長537 nm處測定熒光強度。同時測定細胞裂解液中蛋白質(zhì)含量，以蛋白質(zhì)含量校正裂解液中熒光強度，熒光強度與膽固醇含量成正比，根據(jù)熒光強度判斷膽固醇的攝取和外排。

1.3.3 EGCG對高脂模型大鼠膽固醇代謝的影響

1.3.3.1 大鼠分組及血脂水平測定

將18 只大鼠隨機分為3 組：正常組、高脂模型組、EGCG干預組，適應性養(yǎng)殖1 周后，除對照組繼續(xù)飼喂普通飼料外，余下2 組飼喂高脂飼料（配方（以質(zhì)量分數(shù)計）：74%基礎飼料、15%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇）。同時，EGCG組以200 mg/kg劑量EGCG灌胃，對照組和高脂模型組以相應體積的生理鹽水灌胃，1 次/d，連續(xù)6 周。分別于第0、3、6周眼靜脈叢取血，采用試劑盒檢測不同時間段血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C濃度。

1.3.3.2 大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)測定

不同實驗組大鼠每周稱質(zhì)量一次，第6周處死后剝離大鼠肝臟，吸干表面血跡，同時立即稱質(zhì)量。分離大鼠血清置于-80 ℃冰箱保存，分別用于血脂和膽汁酸含量測定，部分肝臟于液氮保存，用于基因表達水平檢測。肝臟指數(shù)為肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量之比。

1.3.3.3 大鼠肝臟細胞結構變化觀察

將大鼠肝臟切除左側(cè)葉邊緣部分，于體積分數(shù)10%福爾馬林溶液中固定48 h，然后依次經(jīng)85%（體積分數(shù)，下同）乙醇（1 次）、95%乙醇（4 次）、100%乙醇（2 次）、二甲苯（2 次）、石蠟（3 次）脫水，石蠟包埋、切片，制備5 μm厚石蠟切片，脫蠟水化，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后光學顯微鏡下觀察細胞結構變化。

1.3.3.4 大鼠肝臟膽固醇代謝相關基因及蛋白的表達

利用試劑盒進行大鼠肝臟總RNA的提取，采用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進行mRNA逆轉(zhuǎn)錄實驗，嚴格按照說明書操作。相關基因和內(nèi)參基因引物見表1，采用20 μL體系：cDNA 1.0 μL、引物1 0.5 μL、引物2 0.5 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、超純水8 μL。程序為：95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，63 ℃、25 s，40 個循環(huán)。收集熒光，每個樣品重復3 次，各個基因的相對表達量以2（Ct（內(nèi)參基因）-Ct（目的基因））進行計算，分析實驗組與對照組肝臟中相關膽固醇代謝基因的表達差異。

表 1 qPCR引物Table 1 Primer sequences used for qPCR

將肝臟組織剪碎、裂解后，高速冷凍離心，分離上清液于超低溫冰箱保存。按照BCA定量試劑盒說明書方法建立標準曲線，并計算樣品中總蛋白質(zhì)量濃度。分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜后采用ECL試劑盒反應，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有檢測數(shù)據(jù)結果采用 ±s表示，采用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 EGCG對SGC和STC跨膜轉(zhuǎn)運的影響分析

圖 1 EGCG對膽酸鹽SGC和STC在Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運的影響Fig. 1 Effect of EGCG on transport of SGC and STC across Caco-2 cells

如圖1所示，膽汁酸高濃度（2.50 mmol/L）組EGCG能夠顯著抑制SGC和STC從Trans-well小室AP側(cè)進入BL側(cè)（P＜0.05）；同時，在4 h和8 h時，EGCG對SGC的抑制水平顯著強于對STC的抑制（P＜0.05）；而膽汁酸低濃度（0.25 mmol/L）組EGCG對膽汁酸重吸收影響不顯著（P＞0.05）。

2.2 EGCG對膽固醇攝取的影響分析

圖 2 EGCG對膽固醇在Caco-2細胞（A）和BRL細胞（B）中內(nèi)流和外排的影響Fig. 2 Effect of EGCG on cholesterol inf l ux in Caco-2 cells (A) and cholesterol eff l ux from BRL cells (B)

由圖2A可見，在Caco-2細胞內(nèi)，與EGCG濃度為0 μmol/L組相比，EGCG濃度為40 μmol/L組細胞裂解液中熒光強度顯著降低（P＜0.05），說明EGCG能夠顯著抑制Caco-2細胞對膽固醇的攝取。由圖2B可見，BRL細胞內(nèi)，與EGCG濃度為0 μmol/L組相比，EGCG濃度為40 μmol/L組熒光強度顯著降低（P＜0.05），說明EGCG能夠顯著抑制BRL細胞對膽固醇的攝取。

2.3 EGCG對高脂模型大鼠的影響分析

2.3.1 EGCG對大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響分析

表 2 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 2 Mean body mass, liver mass and liver index in rats

由表2可見，第3、6周高脂模型組大鼠體質(zhì)量顯著高于正常組，而EGCG組體質(zhì)量顯著下降。肝質(zhì)量測定結果顯示，模型組大鼠肝質(zhì)量高于正常組，EGCG組大鼠肝質(zhì)量有所下降，但各組間差異不顯著。模型組大鼠肝臟指數(shù)高于正常組，但差異不顯著。

2.3.2 EGCG對大鼠血脂水平影響分析

與高脂模型組相比，第6周EGCG組大鼠血清中TC、LDL-C、TG濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），結果見表3、4。

表 3 大鼠血清中TC和TG濃度Table 3 Serum levels of TC and TG in rats

表 4 大鼠血清中LDL-C和HDL-C濃度Table 4 Serum levels of LDL-C and HDL-C in rats

2.3.3 大鼠肝臟細胞結構變化觀察結果

HE染色結果顯示，正常組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞呈現(xiàn)條索狀排列，細胞結構清晰（圖3A）。高脂模型組肝細胞內(nèi)有脂質(zhì)染色，肝小葉輪廓模糊，肝細胞排列紊亂（圖3B）。EGCG組肝小葉與高脂模型組相比結構相對完整，肝細胞清晰，細胞內(nèi)脂質(zhì)減少（圖3C）。

圖 3 不同處理組肝臟HE染色Fig. 3 Hematoxylin and eosin staining of liver tissues from different groups

2.3.4 EGCG對大鼠膽固醇代謝相關基因表達的影響分析

圖 4 EGCG對膽固醇代謝基因HMGCR（A）、SREBP-2（B）、LXR-α（C）和CYP7A1（D）mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of EGCG on mRNA expression levels of HMGCR (A),SREBP-2 (B), LXR-α (C) and CYP7A1 (D)

由圖4可知，與正常組相比，高脂模型組HMGCR表達明顯升高，SREBP-2、LXR-α及CYP7A1表達則顯著下降（P＜0.05）；與高脂模型組相比，EGCG組HMGCR表達顯著降低，SREBP-2、LXR-α及CYP7A1表達顯著升高（P＜0.05）。如圖5所示，不同處理組大鼠上述4 種基因的蛋白水平變化趨勢與qPCR結果相同。

圖 5 EGCG對膽固醇代謝基因HMGCR（A）、CYP7A1（B）、LXR-α（C）和SREBP-2（D）蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of EGCG on protein expression levels of HMGCR (A),CYP7A1 (B), LXR-α (C) receptor and SREBP-2 (D)

3 討 論

本實驗利用Caco-2細胞模型研究了EGCG對SGC和STC跨膜轉(zhuǎn)運的影響，通過體外細胞模型探索了EGCG調(diào)血脂的可能機制。根據(jù)膽汁酸的腸肝循環(huán)機制，膽汁酸在十二指腸分泌后，在空腸中通過被動擴散重吸收，在回腸通過載體蛋白進行主動重吸收，通過肝門靜脈重新回到肝臟中。如果此環(huán)節(jié)受阻，將會反饋性加速膽汁酸分泌，進而增強肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)變，起到降膽固醇的作用[19]。本研究結果顯示EGCG能夠顯著抑制高濃度（2.50 mmol/L）膽酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運，而其對低濃度（0.25 mmol/L）膽酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運抑制效果不顯著，說明膽汁酸在Caco-2細胞中既有被動吸收又有主動吸收。膽酸鹽濃度較高時，膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白被飽和，EGCG主要通過與膽汁酸的氫鍵結合影響其被動轉(zhuǎn)運過程；膽酸鹽濃度較低時，膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白未飽和，EGCG與膽汁酸氫鍵結合對主動轉(zhuǎn)運影響較弱，此時膽汁酸以主動轉(zhuǎn)運為主。這或許可以解釋高脂飲食條件下EGCG能夠顯著抑制膽汁酸重吸收，而正常或低脂飲食條件下EGCG對血脂影響并不顯著的原因。

NBD-膽固醇在Caco-2細胞內(nèi)攝取和BRL細胞中外排結果顯示，EGCG顯著抑制了Caco-2細胞對NBD-膽固醇的攝取，使得細胞裂解液中熒光強度顯著降低。BRL細胞對膽固醇既有攝取功能又有外排作用，BRL細胞表面LDL受體（LDL receptor，LDL-R）對LDL-C內(nèi)流攝取，從而加速總膽固醇含量的降低。本研究結果表明EGCG組肝細胞裂解液中熒光強度明顯下降，可能是肝細胞對游離膽固醇（NBD-膽固醇）攝取能力減弱或者外排能力增強造成的。

本研究對大鼠肝臟與膽固醇代謝相關的基因表達水平進行檢測，結果顯示EGCG對肝臟中SREBP-2和CYP7A1以及核受體LXR-α基因表達具有顯著增強作用，對HMGCR表達具有顯著抑制功能。HMGCR是內(nèi)源性膽固醇生成限速酶，HMGCR基因的表達降低可以抑制膽固醇合成；CYP7A1為膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)運的限速酶，而核受體LXR-α對于調(diào)控膽固醇ATP結合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運子（ABCA1、ABCG5和ABCG8）具有顯著作用[20-22]，這與BRL細胞對NBD-膽固醇外排能力增強的結果一致。血清LDL-C含量受肝細胞表面LDL-R調(diào)控，而LDL-R又受SREBP-2調(diào)控，SREBP-2使LDL-R表達增多，因此SREBP-2表達的提高能夠引起肝細胞對膽固醇攝取的增加，降低體內(nèi)LDL-C含量，從而發(fā)揮降血脂活性[23]。

有文獻報道綠茶多酚和高脂飲食對機體腸道菌群均具有顯著影響[6-7,24-25]，機體腸道菌群的改變能夠影響膽汁酸代謝過程，而體內(nèi)膽汁酸含量的改變反過來又能夠影響腸道菌群結構，因此，腸道菌群與機體脂質(zhì)代謝緊密相關[26]。本研究雖然對EGCG調(diào)控膽固醇代謝方面進行了探索，但尚有一些問題難以解釋，比如EGCG對小腸上皮細胞中膽汁酸轉(zhuǎn)運體影響如何，以及EGCG通過何種途徑干預膽汁酸跨膜轉(zhuǎn)運，尚需進一步研究。此外，由于EGCG體內(nèi)生物利用度較低和易于代謝[27-29]，其對大鼠肝臟中膽固醇代謝相關基因表達的影響是通過何種途徑或機制發(fā)揮作用，以及膽汁酸和腸道菌群在降血脂過程中是否與EGCG發(fā)揮協(xié)同作用，尚需更加深入的探索。