燒傷復合海水浸泡大鼠的多器官損傷分析

李丹丹，馬偉，胡明，馮友新，瞿秀華，張達矜，喬媛媛

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院，北京100048)

隨著我國海洋經(jīng)濟的發(fā)展，海洋事業(yè)活動日益頻繁，加之海軍執(zhí)行任務半徑增大，海上事故時有發(fā)生，受傷合并燒傷發(fā)生率較高。海水具有特殊的物化性質(zhì)，如高滲、堿性、低溫、有菌等，若傷員墜海則傷口被海水浸泡[1]。燒傷合并海水浸泡會造成傷員電解質(zhì)紊亂、高滲性脫水、酸堿失衡、感染及多臟器功能衰竭，甚至死亡[2]。嚴重燒傷后人體將發(fā)生不同程度的低血容量休克，引起主要器官缺血、缺氧損害，尤其腸道損傷，導致燒傷后全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征(MODS)[3]。2017年10月～2018年2月，本研究以燙傷合并海水浸泡大鼠為模型，觀察燙傷合并海水浸泡后的傷情特點，為研究燒傷合并海水浸泡救治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量(290.3±7.5)g，由軍事醫(yī)學科學院動物研究所提供，晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由飲食，實驗室內(nèi)適應飼養(yǎng)1周。B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)一抗兔多克隆抗體(北京碧云天公司)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)一抗兔多克隆抗體(美國Abcam公司)，PV-9000二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒、SAP-9100試劑盒(中杉金橋公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純。全自動生化分析儀(日立)。

1.2 人工海水配制 根據(jù)國家海洋局第三研究所配方配制。滲透壓(1 250±11)mmol/L，pH 8.2，鈉離子(630±5)mmol/L，鉀離子(10.88±0.68)mmol/L，氯離子(658.8±5.5)mmol/L，溫度(22±1)℃，水溫20～22 ℃。

1.3 動物分組及處理 將大鼠隨機分為正常對照組、單純燒傷組及燒傷浸泡2、6、12、24 h組(n=20)。正常對照組不作處理；單純燒傷組、燒傷浸泡組用1.5%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部30%區(qū)域脫毛，按文獻[4]方法電烙鐵燒5 s，致背部30%總體表面積深Ⅱ度燙傷。燒傷浸泡組致傷后將大鼠置于固定架，浸泡于人工海水中，浸泡平面超過傷口創(chuàng)面，分別浸泡2、6、12、24 h。最終正常對照組、單純燒傷組及燒傷浸泡2、6、12、24 h組分別存活20、20、17、13、14、8只。各組分別取8只大鼠，麻醉后采集其下腔靜脈血，將其處死取肝、肺及腸道組織，于距回盲部5 cm處取小腸組織(長度2 cm)。

1.4 血液指標檢測 肝功能指標：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽汁酸(TBA)；腎功能指標：尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血尿酸(UA)、乳酸脫氫酶(LDH)；應激指標：超敏C反應蛋白(hs-CRP)、血糖；組織代謝及缺氧指標：乳酸(LAC)、乙酰丙酮(ACAC)、血紅蛋白(Hb)；血離子：鉀、鈉、氯、鈣、磷、鎂等離子。

1.5 肝、肺、腸組織病理學變化觀察 取各組肝、肺、腸組織在等滲鹽水中清洗后，于10%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度5 μm)，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，于光鏡下觀察各組織病理變化。

1.6 肝、肺、腸組織中凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2表達檢測 采用免疫組化法。取組織切片，置65 ℃恒溫箱烘烤60 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液各浸泡15 min；各濃度乙醇梯度水化，1×PBS緩沖液洗切片5 min×3次，滴加3%過氧化氫，室溫放置30 min去除內(nèi)源性過氧化物；1×PBS緩沖液洗切片5 min×3次；檸檬酸鹽溶液中煮沸進行抗原熱修復；1×PBS緩沖液洗切片5 min×3次；滴加10%胎牛血清，37 ℃孵育60 min封閉非特異性結(jié)合位點，用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗Bcl-2(稀釋比例1∶100)，Caspase-3(稀釋比例1∶100)，放入濕盒后置于4 ℃冰箱孵育過夜；隔日將切片復蘇1 h，回收一抗，1×PBS緩沖液洗切片5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；1×PBS緩沖液洗切片5 min×3次；顯微鏡下滴加DAB 工作液(稀釋比例1∶200)顯色，出現(xiàn)深棕色后，自來水充分沖洗終止顯色反應；蘇木素復染細胞核；各濃度乙醇梯度脫水，中性樹膠封片置于鏡下觀察。Caspase-3及Bcl-2陽性染色為棕黃色，定位于細胞質(zhì)，以細胞呈清晰棕色或棕褐色為陽性。用PBS代替一抗做陰性對照。計算各組蛋白陽性表達率[5]。

2 結(jié)果

2.1 各組肝功能指標比較 與正常對照組比較，單純燒傷組、燒傷浸泡組AST、ALT水平高(P均<0.05)；燒傷浸泡2、6、12、24 h組AST、ALT水平逐漸升高(P均<0.05)，且燒傷浸泡6、12、24 h組AST、ALT水平均高于單純燒傷組(P均<0.05)。各組肝功能其他指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2 各組腎功能指標比較 與正常對照組比較，單純燒傷組、燒傷浸泡組BUN、LDH水平高(P均<0.05)；與單純燒傷組比較，燒傷浸泡24 h組AST、 ALT水平高(P均<0.05)。各組其他肝功能指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。與正常對照組比較，燒傷浸泡2 h組SCr低(P<0.05)。燒傷浸泡組UA雖升高，但與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組肝功能指標比較

表2 各組腎功能指標比較

2.3 各組應激及組織代謝、缺氧指標比較 燒傷浸泡組hs-CRP水平逐漸升高，燒傷浸泡12、24 h組hs-CRP水平較正常對照組和單純燒傷組高(P均<0.05)；燒傷浸泡2、6、12 h組血糖先升高，浸泡24 h組血糖降低，浸泡12 h組血糖與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。燒傷浸泡組ACAC與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與單純燒傷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。燒傷浸泡組Hb逐漸升高，燒傷浸泡6、12、24 h組Hb與正常對照組、單純燒傷組比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3 各組應激及組織代謝、缺氧指標比較

2.4 各組血離子水平比較 燒傷浸泡2 h組血鈉、氯較正常對照組高(P均<0.05)，燒傷浸泡6、12、24 h組血鈉、氯較正常對照組、單純燒傷組高(P均<0.05)。燒傷浸泡2 h組血鉀、鈣較正常對照組高(P均<0.05)；燒傷浸泡2、6 h組血磷、鎂升高，血鎂較正常對照組高(P<0.05)，血磷較正常對照組、單純燒傷組高(P均<0.05)。燒傷浸泡12、24 h組血鉀、鈣、磷、鎂與正常對照組、單純燒傷組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組血離子水平比較

2.5 各組肝、肺、腸組織病理學改變比較 肝臟組織病理改變：正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；單純燒傷組肝細胞腫脹，胞質(zhì)疏松，甚至空泡化或嗜酸性變，肝竇變窄，肝竇腔內(nèi)有多形核白細胞聚集；燒傷浸泡24 h組肝細胞線粒體退變，大量脂質(zhì)小體形成，核皺縮,異染色質(zhì)邊集，竇內(nèi)皮細胞高度腫脹。肺臟組織病理改變：正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)及肺泡壁無水腫；燒傷組肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，有少部分肺間質(zhì)及肺泡壁輕度水腫；燒傷浸泡24 h組有明顯肺間質(zhì)及肺泡腔水腫，紅細胞溢出，肺泡間質(zhì)增厚，炎性細胞浸潤；小血管周圍間隙增寬，并可見片狀出血。腸組織病理改變：正常對照組腸黏膜形態(tài)正常，腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊，上皮細胞排列整齊，間質(zhì)無水腫；腸黏膜絨毛破壞明顯，絨毛頂端上皮有片狀壞死、脫落絨毛間質(zhì)疏松，間質(zhì)充血及炎細胞浸潤。

2.6 各組肝、肺、腸組織中Caspase-3、Bcl-2蛋白表達比較 正常對照組肝、肺、腸組織中Caspase-3蛋白陽性表達率均為0，單純燒傷組分別為12.5%(1/8)、37.5%(3/8)、50%(4/8)，燒傷浸泡24 h組分別為50%(4/8)、100%(8/8)、100%(8/8)，各組肝、肺、腸組織中Caspase-3蛋白陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；正常對照組肝、肺、腸組織中Bcl-2蛋白陽性表達率均為100%，單純燒傷組分別為37.5%(3/8)、50%(4/8)、37.5%(3/8)，燒傷浸泡24 h組均為0。各組肝、肺、腸組織中Bcl-2蛋白陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

3 討論

海水中含有高濃度的鈉、鉀、氯離子[6]及大量致病菌[7]，同時還具有低溫、強散熱的特性。研究表明，燒傷合并海水浸泡會造成機體高滲性脫水、電解質(zhì)紊亂、酸堿失衡、血流動力學紊亂，加重組織缺血、缺氧性損害[8]。文獻報道胸部開放傷后海水浸泡可對大鼠、豬、狗等實驗動物的呼吸、循環(huán)系統(tǒng)及全身水、電解質(zhì)平衡造成嚴重影響，甚至引起MODS[9]。

肝臟是機體物質(zhì)代謝最旺盛的器官之一，當機體遭受創(chuàng)傷而發(fā)生應激反應時，肝臟細胞會首先受到影響。其中ALT、AST的活性可反映肝細胞受損情況。本研究中大鼠燒傷合并海水浸泡組血液中ALT、AST水平比正常對照組、單純致傷組高，表明其肝臟組織受損，有炎癥細胞浸潤，進而影響機體正常的代謝功能。

UA、SCr及BUN是臨床常用的反映腎功能的指標。其中UA可反映腎小球的濾過功能。本研究中燒傷合并海水浸泡組BUN較正常對照組和單純致傷組高。BUN變化較靈敏，可反映早期腎功能不全，當機體主要臟器出血及機體嚴重缺水時，BUN會顯著升高。LDH催化碳水化合物代謝中無氧酵解的最終反應，其廣泛存在于各種組織和器官內(nèi)，細胞受損傷后將多種酶釋放到細胞外，其活力與細胞損傷程度呈正相關。由于燒傷合并海水浸泡導致大鼠主要臟器處于缺水、缺血及缺氧等應激狀態(tài)，受損細胞釋放大量的LDH進入血液，故血清LDH水平升高。而燒傷合并海水浸泡組UA和SCr水平雖有改變，但變化不大，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。有研究認為，腎濾過率低于50%時SCr才會明顯升高[10]。這可能由于腎臟抗應激能力強，在一定范圍內(nèi)可維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)態(tài)。

創(chuàng)傷后組織會存在缺血缺氧改變。ACAC及LAC是反映機體組織循環(huán)障礙及缺氧的指標。本研究燒傷合并浸泡組LAC雖升高但差異無統(tǒng)計學意義，而ACAC變化顯著。當缺血缺氧時，機體進行無氧代謝產(chǎn)生乳酸，乳酸再形成大量的ACAC，而ACAC形成糖原的能力變?nèi)酰蕶C體堆積大量的ACAC，導致血液中ACAC水平升高。此外，當燒傷合并海水浸泡后，組織細胞和紅細胞受損，會釋放大量的炎癥介質(zhì)和Hb，故血清中hs-CRP和游離Hb相應升高。

鉀、鈣、磷、鎂、氯、鈉等離子是組成人體重要的物質(zhì)。燒傷合并浸泡組血離子水平較正常對照組、單純燒傷組高。血液中鈣、磷、鎂、鉀水平依賴于腸道及腎臟調(diào)節(jié)。調(diào)控鈣、磷代謝的激素有甲狀旁腺素、甲狀腺素等，其相互作用可維持血液離子濃度的正常水平。當機體受到創(chuàng)傷時，大量失血及缺氧等應激因素造成腸、腎、激素功能失調(diào)，進而引起血液中鈣、磷、鎂、鉀等離子水平變化。

Bcl-2、Caspase-3與細胞凋亡密切相關，二者主要位于細胞質(zhì)內(nèi)。其中Caspase-3屬于白細胞介素1β轉(zhuǎn)換酶家族，是細胞凋亡的執(zhí)行者[11]。Bcl-2是一種與膜穩(wěn)定性相關的蛋白，通過細胞催化抗氧化作用、離子通道蛋白和吸附/錨定蛋白，抑制Caspase-3的活化，阻斷細胞凋亡，提高細胞存活能力[10]。正常情況下，Caspase-3以無活性酶原形式存在，被激活為活性的Caspase-3時可引起細胞凋亡。本研究燒傷浸泡組肝、肺、腸組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)變化最大，肝、肺、腸組織中Caspase-3蛋白陽性表達率最高、Bcl-2蛋白陽性表達率最低。嚴重燒傷合并海水浸泡導致消化道血供急劇減少，組織毛細血管微循環(huán)障礙，缺血缺氧引起酸中毒，自由基和炎性介質(zhì)等水平升高，與凋亡相關的基因表達增強，啟動了內(nèi)源性和外源性及其他細胞凋亡激活途徑，誘導內(nèi)皮細胞、淋巴細胞和腸黏膜上皮細胞凋亡，腸黏膜上皮細胞穩(wěn)態(tài)被打破，產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應，誘發(fā)膿毒癥及MODS[12]。

海水浸泡會加重燒傷后肝、肺及腸道組織結(jié)構(gòu)破壞和屏障功能損傷。在致傷浸泡短時間內(nèi)海水溫度較低，因此還是保護因素。本研究部分結(jié)果也提示燒傷浸泡2 h組肝腎功能指標較單純燒傷組有改善，但隨著浸泡時間的延長，機體損傷加重。嚴重燒傷后主要組織臟器缺血、缺氧，使組織中細胞保護因子水平降低，組織自我修復及保護功能減弱；而大量增加的炎癥介質(zhì)促進細胞凋亡。此外海水高致病菌、高鹽、低溫及強散熱作用引起高滲性脫水、電解質(zhì)紊亂、血流動力改變和心功能損害。因此，燒傷合并海水浸泡會加重腸道、肺臟及肝臟等的損傷，但機體對燒傷合并海水浸泡后的調(diào)節(jié)機制，特別是對內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)機制，尚不清楚，需進一步研究。