刺五加內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. CWJ-256次生代謝產(chǎn)物研究

王新位，郭文強(qiáng)，趙建元，余利巖，席楠，何寧，王珊珊，袁麗杰，解云英

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刺五加內(nèi)生放線菌CWJ-256次生代謝產(chǎn)物研究

王新位，郭文強(qiáng)，趙建元，余利巖，席楠，何寧，王珊珊，袁麗杰，解云英

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（王新位、郭文強(qiáng)、趙建元、余利巖、席楠、何寧、王珊珊、解云英）；063000 唐山，華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（袁麗杰）

研究刺五加植物內(nèi)生放線菌 CWJ-256 次級(jí)代謝產(chǎn)物及其生物活性。

采用 16S rRNA 基因同源進(jìn)化分析對(duì)菌株 CWJ-256 進(jìn)行初步分類鑒定，采用抗菌活性追蹤方式，對(duì) CWJ-256 發(fā)酵液通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、薄層色譜顯色以及高效液相色譜等方法對(duì)目標(biāo)化合物分離純化，利用核磁共振波譜法和質(zhì)譜法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。采用 MTT 法測(cè)試其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性?；贕luc 報(bào)告系統(tǒng)對(duì)化合物3 的體外抗流感病毒藥效學(xué)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

菌種鑒定顯示CWJ-256 為生黑孢鏈霉菌；從該菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分離得到 3 個(gè)活性化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為efomycin G（化合物 1）、11,11'-O,O-dimethylelaiophylin（化合物 2）、elaiophylin（化合物 3）；抗腫瘤細(xì)胞增殖活性評(píng)價(jià)顯示，化合物1 和3 對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 具有增殖抑制作用（IC50分別為4.385 和2.118 μmol/L）。體外抗流感病毒藥效學(xué)評(píng)價(jià)顯示，化合物3 對(duì)流感病毒A/WSN/33(H1N1) 具有一定抑制效果。

刺五加內(nèi)生放線菌CWJ-256 可產(chǎn)生多個(gè)洋橄欖葉素類次生代謝產(chǎn)物，顯示出抗細(xì)胞增殖、抗病毒等多種活性。

刺五加△； 內(nèi)生放線菌； 洋橄欖葉素； 抗腫瘤活性； 抗流感病毒活性

植物內(nèi)生菌（endophytes）是一類部分或整個(gè)生活史都在健康植物組織細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，并且不會(huì)造成植物明顯的致病癥狀的微生物，包括細(xì)菌、放線菌、真菌[1]。由于這些微生物生活在植物組織內(nèi)部，而植物并沒有明顯的外在感染癥狀，所以內(nèi)生菌的存在和作用長期以來被忽視。直至 20 世紀(jì) 30 年代，發(fā)現(xiàn)造成畜牧業(yè)重大損失是由于牲畜食用了感染內(nèi)生真菌的牧草，才開始對(duì)內(nèi)生菌的深入研究[1]，研究表明內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用。有學(xué)者從歐洲紅豆杉中分離到內(nèi)生真菌 Acremonium sp.，其能產(chǎn)生一系列抗真菌、抗癌的肽類活性物質(zhì)。研究表明植物內(nèi)生菌同土壤微生物相比，在發(fā)現(xiàn)新的生物活性產(chǎn)物方面具有更大潛力[2]。在以往的研究中，內(nèi)生菌所涉及的大都是內(nèi)生真菌，之后才擴(kuò)展到內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌的范疇[3]。

刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms，來源于五加科（Araliaceae）五加屬（Acanthopanax），是一種名貴的藥用植物。刺五加含有能產(chǎn)生抗腫瘤、抗菌等作用的多種有效成分[4]，如胡蘿卜苷、丁香苷等苷類化合物，葡萄糖、阿拉伯糖等多糖和黃酮等具有人參樣藥理功效的成分，還含有香豆素、脂肪酸、揮發(fā)油、氨基酸及微量元素等[5]。藥用植物內(nèi)生放線菌綜合了內(nèi)生菌、放線菌及藥用植物三方面的特性和優(yōu)勢(shì)，成為尋找新型微生物代謝產(chǎn)物的又一重要資源[6]，而且國內(nèi)外少見對(duì)藥用植物刺五加內(nèi)生放線菌的研究報(bào)道。因此，我們選定本實(shí)驗(yàn)室保存的具有抗金黃色葡萄球菌活性的刺五加內(nèi)生放線菌株 256 作為研究對(duì)象，采用活性追蹤的方式，從其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中分離得到了3 個(gè)具有抗菌活性的系列化合物256-2（化合物1）、256-3（化合物2）、256-4（化合物3），經(jīng)鑒定，結(jié)構(gòu)分別與糖基化大環(huán)內(nèi)酯類抗生素洋橄欖葉素類抗生素 efomycin G、11,11'-O,O-dimethylelaiophylin、elaiophylin 結(jié)構(gòu)相同。三種產(chǎn)物具有良好的抗菌活性，且對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 增殖有抑制作用，其中化合物3 對(duì)流感病毒A/WSN/33(H1N1) 顯示出一定的抑制活性。

菌株經(jīng)過鑒定，確定為生黑孢鏈霉菌。本文報(bào)道該菌株的菌種鑒定和次生代謝產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、抗乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 增殖活性、抗流感病毒A/WSN/33(H1N1) 活性以及初步的抗腫瘤活性構(gòu)效學(xué)關(guān)系研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 刺五加內(nèi)生放線菌CWJ-256 分離自藥用植物刺五加，由華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院袁麗杰教授課題組提供，在本課題組實(shí)驗(yàn)室保存。檢定菌金黃色葡萄球菌（ATCC25923）由中國藥學(xué)微生物菌種保藏中心（CPCC）提供。

1.1.2 色譜填料和試劑 丙酮、石油醚、甲醇、氯仿、二氯甲烷均為分析純，購自北京化工廠；色譜級(jí)甲醇和乙腈購自迪馬科技有限公司；Chelex-100 Resin 樹脂購自上海美吉生物有限公司；PCR 引物及常規(guī)試劑分別購自上海生工生物工程股份有限公司；復(fù)合維生素購自美國惠氏制藥有限公司；4006 大孔吸附樹脂購自南開大學(xué)精細(xì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠；硅膠 GF254（100 ~ 200 目和 200 ~300 目）購自青島海洋化工廠；葡聚糖凝膠 LH-20 購自上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠；分析型色譜柱 Shimadzu ODS-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）購自日本島津公司；半制備型色譜柱 ReproSil-Pur Basic C18 柱（10 mm × 250 mm，5 μm）購自德國 Brueckle 公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 ISP2：酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖 4.0 g/L、麥芽浸粉 10.0 g/L、復(fù)合維生素 250 mg/L、微量鹽（FeSO4·7H2O 0.2 g、 MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、去離子水 100 ml）0.5 ml/L、瓊脂 18.0 g/L、去離子水配制，pH 7.2 ~ 7.4，121 ℃高壓滅菌 30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：普通淀粉 25 g/L、葡萄糖 5 g/L、蛋白胨 3 g/L、牛肉膏 3g/L、CaCO32.5 g/L、微量元素（FeSO41.0 g、MnCl21.0 g、ZnSO41.0 g、CuSO41.0 g、CoCl21.0 g、蒸餾水 1000 ml）1.0 g/L，自來水配制，pH 7.2，121 ℃高壓滅菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株CWJ-256 的種屬鑒定 16S rRNA 基因擴(kuò)增 Chelex-100 法提取基因組 DNA。采用通用引物：27f（5' AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3'）和 1525r（5' AGAAAGGAGGTG TACCAGCC 3'）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化由寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。將所測(cè)序列在 GenBank 做 BLAST 比對(duì)，取相似性較高的菌株用 CLUSTAL X 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用 MEGA2.1 軟件包中的鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建供試菌與參比菌之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2CWJ-256 發(fā)酵 將 8 支于 28 ℃已培養(yǎng) 6 d、生長良好、長滿孢子的CWJ-256 試管斜面（ISP2 培養(yǎng)基）用無菌鐵鏟刮取 1/4 接種于 5 L 三角瓶（含有 1 L 發(fā)酵培養(yǎng)基）中，共 32 瓶，于 28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng) 7 d，獲得液體發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.3CWJ-256 活性代謝產(chǎn)物初步分離與分析 收集菌株CWJ-256的發(fā)酵液（32 L）經(jīng) 4500 r/min 離心 25 min，棄去上清液。將菌絲體用 1 倍體積的丙酮超聲提取 2 h，過夜浸泡，過濾獲得丙酮提取液，減壓濃縮。再次加入 1 倍體積的丙酮，超聲 1 h 二次提取，得到粗品 6 g。粗品溶解后拌入 2 倍重量硅膠，減壓蒸餾揮去有機(jī)試劑，樣品采用干法上樣，減壓硅膠柱層析（硅膠 G 200 ~ 300 目）分離得到 4 個(gè)組分。對(duì)所得組分進(jìn)行 HPLC 分析，根據(jù)其 HPLC 圖譜及抗菌活性測(cè)試結(jié)果，確定組分 4 為主要代謝產(chǎn)物以及主要活性組分，液相檢測(cè)其最大紫外吸收為 250 nm 左右，且成系列吸收峰。

1.2.4CWJ-256 活性代謝產(chǎn)物的純化 針對(duì)組分 4 采用加壓硅膠柱層析（二氯甲烷:甲醇= 15:1）法得到 6 個(gè)組分（4-1、4-2、4-3、4-4、4-5 和4-6），對(duì) 6 個(gè)組分進(jìn)一步進(jìn)行HPLC 分析（甲醇-水，梯度 50% ~ 100% ，30 min；流速 1 ml/min；檢測(cè)波長250 nm；柱溫箱30 ℃），抗MRSA 活性跟蹤顯示主要活性組分集中于4-5 和4-6。將組分 4-5 和 4-6 合并（1.2 g），采用中壓制備色譜法（甲醇-水，梯度 50% ~ 100%，55 min；流速 10 ml/min；檢測(cè)波長245 nm）得到多個(gè)流分，再次經(jīng) HPLC分析，合并組分31 ~ 35、41 ~ 44 和50 ~ 53。

31 ~ 35 組分流動(dòng)相溶解后行制備 HPLC，83% 甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測(cè)波長 250 nm，得到化合物 1。

本研究受訪者學(xué)歷、工作年限、職稱等分布較為均衡，但來自二級(jí)及二級(jí)以上者較多，而醫(yī)院級(jí)別影響眼科醫(yī)師對(duì)指南認(rèn)知和應(yīng)用情況，加之調(diào)查對(duì)象的選擇未采用隨機(jī)抽樣的方法，因此結(jié)果可能存在偏倚。在本次研究的基礎(chǔ)上，如果相關(guān)學(xué)會(huì)或者政府相關(guān)部門牽頭進(jìn)行全面調(diào)查，其結(jié)果可能會(huì)更準(zhǔn)確。

41 ~ 44 組分流動(dòng)相溶解后行制備 HPLC，85% 甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測(cè)波長 250 nm，得到化合物 3。

50 ~ 53 組分流動(dòng)相溶解后行制備 HPLC，90%甲醇等度洗脫，流速 4 ml/min，檢測(cè)波長 250 nm，得到化合物 2。

1.2.5 抗菌活性及抗細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 抗菌活性檢測(cè)采用紙片擴(kuò)散法，具體為：吸取待測(cè)液約20 μl，吸附于直徑 5.0 mm 濾紙片，揮干有機(jī)試劑，貼附在含有金黃色葡萄球菌檢定菌的平皿表面，37 ℃培養(yǎng) 12 ~ 18 h，觀察抑菌圈有無及大小。抗細(xì)胞增殖活性使用 MTT 法測(cè)定，將人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 接種于 96 孔板，細(xì)胞濃度為 5 × 104個(gè)/ml，每孔 200 μl，培養(yǎng) 24 h 后加入待測(cè)化合物，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，加入 MTT 再培養(yǎng) 4 h，然后加入 DMSO 150 μl/孔，于 570 nm 測(cè)定吸光度（570），計(jì)算增殖抑制率：

增殖抑制率（%）=（1 –試驗(yàn)孔/對(duì)照孔）× 100%

分別測(cè)定不同濃度的增殖抑制率，據(jù)此確定 IC50（μmol/L）值。每個(gè)濃度設(shè) 5 孔重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.6 基于 Gluc 報(bào)告系統(tǒng)的抗甲型流感病毒活性測(cè)定 方法參考文獻(xiàn)[7]：使用293T 衍生系細(xì)胞293T-Gluc mono6 細(xì)胞鋪96 孔板，每孔接種2.5 × 104個(gè)，于100 μl 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板24 h 后每孔加入1 μl 待測(cè)化合物 3（化合物母液濃度為 30 和 10 μmol/L），對(duì)照組陽性化合物為利巴韋林，母液濃度120 μmol/L。化合物加入1 h 后，甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1) 以MOI 0.2 進(jìn)行病毒感染。24 h 后各取10 μl 檢測(cè)上清液中Gluc 蛋白含量，測(cè)量結(jié)果以相對(duì)光單位（RLU）表示，計(jì)算所測(cè)樣品對(duì)甲型流感病毒的抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1 Streptomyces sp. CWJ-256 的種屬鑒定

菌株CWJ-256 的16S rRNA基因序列經(jīng)過擴(kuò)增并測(cè)序后，得到16S rDNA序列。

在 EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST，結(jié)果表明，其與NBRC 12839T（AB184185）、DSM 40830T（AY508511）、NRRL B-3602T（DQ334781）、NBRC 13061T（AB 184283）、NRRL B-1346T（EF408735）、NBRC 100778T（AB249941）NBRC 100767T（AB249934）、NBRC 101000T（AB249962）的相似性在98.88% ~ 99.70% 之間。運(yùn)用 CLUSTAL X 軟件進(jìn)行序列比對(duì)并計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株與以上參比標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的序列相似性。運(yùn)用 MEGA version 5.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中菌株 256 與標(biāo)準(zhǔn)菌株NBRC 13061T（AB184283）的序列相似度高達(dá) 99.70%，聚在同一個(gè)進(jìn)化分支上（圖 1）。由此推斷菌株 256 為。

2.2 化合物 1、2、3 的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

CWJ-256 發(fā)酵培養(yǎng)物菌絲體部分經(jīng)過兩次等體積丙酮萃取，粗品經(jīng)過 HPLC 分析后得到紫外吸收相近的系列化合物（圖 2），經(jīng)過硅膠柱色譜和半制備型 HPLC 分離純化后，得到 3 個(gè)化合物 256-2（化合物 1，白色粉末，12.5 mg）、256-3（化合物 2，白色粉末，10.4 mg）、256-4（化合物 3，白色粉末，15.4 mg）。LC-MS 結(jié)果顯示，26.0 min（化合物 1）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1033.2，29.9 min（化合物 3）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1047.2，32.8 min（化合物 2）洗脫峰給出 [M+Na]+峰為1075.2。核磁數(shù)據(jù)顯示，化合物 1 氫譜中給出 43個(gè)氫信號(hào)，碳譜中給出 27 個(gè)碳信號(hào)；化合物 2 氫譜共給出 46 個(gè)氫信號(hào)，碳譜給出 28 個(gè)碳信號(hào)；化合物 3 氫譜中共給出 44 個(gè)氫信號(hào)，碳譜給出 27 個(gè)碳信號(hào)。通過微譜13C-NMR 數(shù)據(jù)庫檢索并查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]，對(duì)比文獻(xiàn)報(bào)道中13C-NMR 圖譜數(shù)據(jù)，初步推測(cè)化合物 1 ~ 3 分別為 efomycin G、11,11'-O,O-dimethyleliophylin、elaiophylin，分子式分別為 C53H86O18、C56H92O18、C54H88O18（圖 3），為洋橄欖葉素類化合物。因該類化合物結(jié)構(gòu)顯示出高度對(duì)稱性，所以其核磁信號(hào)僅給出一半，另一半基本重合。此外，化合物 1核磁分析溶劑為CD3OD，結(jié)構(gòu)中的羥基活潑氫信號(hào)未出現(xiàn)。將所得化合物的一維核磁數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)報(bào)道的化合物efomycin G、11,11'-O,O-dimethyleliophylin、elaiophylin的核磁數(shù)據(jù)[12-13]比對(duì)，結(jié)果顯示其譜圖一致，化合物 1 具體信號(hào)歸屬見表 1，化合物 2、3 具體信號(hào)歸屬見表 2。

圖 1 菌株 256 與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Figure 1 Phylogenetic tree of strain 256 and related type strains

圖 2 化合物 1 ~ 3 的 HPLC 圖譜

Figure 2 The HPLC analysis of compounds 1 - 3

1：R1 = R2 = R3 = H 2：R1 = R2 = R3 = CH3 3：R1 = CH3，R2 = R3 = H

Figure 3 Chemical structures of compounds 1 - 3

表1 化合物1 的NMR數(shù)據(jù)（CD3OD-d4）

表 2 化合物2、3的NMR數(shù)據(jù)（DMSO-d6）

續(xù)表 2

δH mult. [J in (Hz)]δCδH mult. [J in (Hz)]δC 15，15'3.39，m66.993.77，m65.11 16，16'1.13，d（6.1）19.021.06，d（6.1）19.47 17，17'0.98，d（6.5）15.660.98，d（6.5）15.83 18，18'0.86，d（7.3）10.030.80，d（6.5） 9.86 19，19'0.84，d（7.2） 7.320.87，d（7.0） 7.28 20，20'a1.61，m18.841.59，m19.12 20，20'b1.38，m1.39，m 21，21'0.79，t（7.5） 8.890.79，t（6.5） 9.09 22，22'4.92，d（3.2）92.564.93，d（3.1）92.80 23，23'a1.80，td（12.3，3.7）32.741.81，m32.97 23，23'b1.38，m1.39，m 24，24'3.72，m65.013.72，m65.23 25，25'3.39，m70.383.39，s70.58 26，26'3.74，m66.443.74，m66.71 27，27'1.07，d（6.5）17.221.09，d（6.5）17.42 OMe-11，11'2.95，s45.74 OH-9，9'4.38，d（7.3） 4.47，d（6.8） OH-11，11' 5.42，s OH-24，24'4.52，d（4.9） 4.50，d（5.8） OH-25，25'4.27，d（4.4） 4.26，d（4.5）

Figure 4 Effects of multiple concentrations of compounds 1 - 3 on proliferation of MDA-MB-231 cell line (A: Compound 1; B: Compound 2; C: Compound 3)

2.3 化合物 1、2、3 的抗菌活性及體外抗癌細(xì)胞MDA-MB-231 活性測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該類化合物具有細(xì)胞周期抑制劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的功能[8-9]，因此，利用 MTT 法對(duì)化合物 1、2、3 的體外抗乳腺癌細(xì)胞增殖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中化合物 2 測(cè)定 4 個(gè)濃度值的抗細(xì)胞增殖活性，化合物 1、3 分別測(cè)定 5 個(gè)濃度值的抗細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示均對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 增殖具有差異性抑制作用（圖4），化合物 1、3對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，IC50分別為4.385、2.118 μmol/L，而化合物 2 對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞增殖抑制活性較低，IC50> 75 μmol/L。

2.4 基于 Gluc 報(bào)告系統(tǒng)的化合物 3 抑制甲型流感病毒活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物3在0.1 μmol/L 和0.3 μmol/L 的濃度下對(duì)甲型流感病毒A/WSN/33 (H1N1) 抑制率分別為30.29% 和35.27%（表3），且在該濃度下細(xì)胞生長良好，未表現(xiàn)出較大的細(xì)胞毒性，初步說明該化合物對(duì)甲型流感病毒具有一定的抑制效果。

表 3 化合物 3 對(duì)流感病毒敏感株A/WSN/33(H1N1) 的抑制活性

2.5 化合物 1，2、3 初步構(gòu)效關(guān)系研究

化合物1、2、3的體外抗腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231活性結(jié)果顯示差異，對(duì)比化合物 2 和 3，兩者的唯一區(qū)別在于 C-11 位和 C-11' 位上有無甲基取代，化合物 3 在 C-11 位和 C-11'位上無甲基取代，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 顯示出良好的抑制增殖活性；而化合物 2 在 C-11 位和C-11'位上的羥基均被甲基化，活性明顯降低，由此推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)中 C-11 位和 C-11'位的羥基為活性必需基團(tuán)。吳春彥等[11]關(guān)于elaiophylins化合物抗人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的活性研究結(jié)果及Ritzau 等[9]關(guān)于elaiophylins 化合物對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞抑制活性結(jié)果研究佐證了這一推測(cè)。

3 討論

洋橄欖葉素類化合物常見抗菌及抗腫瘤細(xì)胞活性報(bào)道，尚未見抗病毒活性報(bào)道，化合物3 的體外抗流感病毒藥效學(xué)評(píng)價(jià)顯示，其對(duì)流感病毒藥物敏感株A/WSN/33(H1N1) 有一定的抑制活性，但尚不具備抗病毒成藥性，今后可通過對(duì)其結(jié)構(gòu)修飾與改造進(jìn)一步研究。依據(jù)本研究中體外抗人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 增殖活性結(jié)果及文獻(xiàn)[8，12-13]報(bào)道的抗腫瘤細(xì)胞活性結(jié)果，推測(cè)化合物 3 C-11 位和 C-11'位羥基可能為活性必需基團(tuán)，烷基取代能夠降低其抗細(xì)胞增殖活性；而化合物 2 C-11 位和 C-11'位甲基取代可能是由于制備過程中化合物 3 結(jié)構(gòu)中活潑的半縮醛與甲醇反應(yīng)產(chǎn)生的[13]。因此，在制備過程中應(yīng)避免使用帶有羥基的溶劑。

[1] Slippers B, Wingfield MJ. Botryosphaeriaceae as endophytes and latent pathogens of woody plants: diversity, ecology and impact. Fungal Biol Rev, 2007, 21(2):90-106.

[2] Schulz B, Boyle C, Draeger S, et al. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycol Res, 2002, 106(9):996-1004.

[3] Guo LD. Advances of researches on endophytic fungi. Mycosystema, 2001, 20(1):148-152. (in Chinese)

郭良棟. 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展. 菌物系統(tǒng), 2001, 20(1):148-152.

[4] Zhang DH. Research on pharmacognosy and preparation of acanthopanax senticosus leaves. Changchun: Changchun University of Chinese Medicine, 2012. (in Chinese)

張德花. 刺五加葉生藥學(xué)及其制劑研究. 長春: 長春中醫(yī)藥大學(xué), 2012.

[5] Huang GX. Pharmacological research and clinical application of acanthopanax senticosus. Lishizhen Med Materia Med Res, 2002, 13(8):496-497. (in Chinese)

黃桂香. 刺五加藥理研究及臨床應(yīng)用概況. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2002, 13(8):496-497.

[6] Huang XH, Li S, Tan ZJ, et al. Progress of study on endophytic actinomycetes in plant. Biotechnol Bull, 2008, 24(1):42-46. (in Chinese)

黃曉輝, 李珊, 譚周進(jìn), 等. 植物內(nèi)生放線菌研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2008, 24(1):42-46.

[7] Gao Q, Wang Z, Liu Z, et al. A cell-based high-throughput approach to identify inhibitors of influenza A virus. Acta Pharm Sin B, 2014, 4(4):301-306.

[8] Cui CB, Wang H, Han B, et al. Elaiophylins, new cell cycle inhibitors and apoptosis inducers, produced by Streptomyces pseudoverticillus II. Structures and biological properties. Chin J Antibiot, 2001, 26(1):19- 24.

[9] Ritzau M, Heinze S, Fleck WF, et al. New macrodiolide antibiotics, 11-O-monomethyl- and 11, 11'-O-dimethylelaiophylins, from Streptomyces sp. HKI-0113 and HKI-0114. J Nat Prod, 1998, 61(11): 1337-1339.

[10] Yan SL, Huang WY, Wang SM, et al. Structural and pathogenic features of endotracheal tube biof ilm in patients undergoing mechanical ventilation. Chin Jou Antibiot, 2001, 26(3):161-164, 203. (in Chinese)

嚴(yán)淑玲, 黃為一, 王世梅, 等. 吸水鏈霉菌NND52菌株胞內(nèi)抗生素M1分離、純化及結(jié)構(gòu)確定. 中國抗生素雜志, 2001, 26(3):161- 164, 203.

[11] Wu CY, Tan Y, Gan ML, et al. Isolation and characterization of elaiophylins from the marine-derived Streptomyces sp. 7-145. Chin

J Antibiot, 2014, 39(3):186-192. (in Chinese)

吳春彥, 譚億, 甘茂羅, 等. 海洋鏈霉菌7-145中洋橄欖葉素衍生物的分離鑒定. 中國抗生素雜志, 2014, 39(3):186-192.

[12] Gan M, Liu B, Tan Y, et al. Saccharothrixones A-D, tetracenomycin-type polyketides from the marine-derived actinomycete Saccharothrix sp.

10-10. J Nat Prod, 2015, 78(9):2260-2265.

[13] Wu C, Tan Y, Gan M, et al. Identification of elaiophylin derivatives from the marine-derived actinomycete Streptomyces sp. 7-145 using PCR-based screening. J Nat Prod, 2013, 76(11):2153-2157.

Study on the secondary metabolites of an endophyticCWJ-256 isolated from

WANG Xin-wei, GUO Wen-qiang, ZHAO Jian-yuan, YU Li-yan, XI Nan, HE Ning, WANG Shan-shan, YUAN Li-jie, XIE Yun-ying

Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WANG Xin-wei, GUO Wen-qiang, ZHAO Jian-yuan, YU Li-yan, XI Nan, HE Ning, WANG Shan-shan, XIE Yun-ying); Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China (YUAN Li-jie)

The aim of the study is to isolate and identify the bioactive secondary metabolites from the fermentation broth of the endophytic. CWJ-256 isolated from the plant.

Phylogenetic analyses were based on 16S rRNA gene sequence. The bioactive metabolites were isolated by silica gel chromatography and preparative HPLC by guidance of antibacterial activity. HRMS and NMR were employed to characterize the structures of purified compounds. The anti-proliferation activities against human breast cancer cells were assayed by MTT, and the anti-influenza virus activities were tested by Gluc report system.

CWJ-256 was identified as. Three compounds were isolated and identified as efomycin G (1), 11,11'-O,O-dimethylelaiophylin (2), elaiophylin (3), respectively. Compounds 1 and 3 displayed anti-proliferation potential against human breast cancer cell MDA-MB-231, and the compound 3 showed weak activity against influenza virus A/WSN/33(H1N1).

TheCWJ-256 can produce elaiophylin and its analogues which exhibited antibacterial, antitumor and anti-virus activities.

ACANTHOPANAX SENTICOSUS; Endophytic actinomycetes; Elaiophylin; Anti-proliferation potential; Anti-influenza virus activity

XIE Yun-ying, Email: xieyy@imb.pumc.edu.cn; YUAN Li-jie, Email: yuanlijie1970@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.003

北京市自然科學(xué)基金（7172137）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-2-002）；河北省自然科學(xué)基金（C2014209137）

解云英，Email：xieyy@imb.pumc.edu.cn；袁麗杰，Email：yuanlijie1970@163.com

2018-04-26