基于16S rRNA和COI基因序列的柔魚亞科系統(tǒng)進化關(guān)系探討

任桂靜，唐峰華，馬春艷，張鳳英，馬凌波

（中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

柔魚科（Ommastrephidae）隸屬于軟體動物門（Mollusca）頭 足 綱 （Cephalopoda）槍 形 目（Teuthoidea），一般根據(jù)形態(tài)特征劃分為柔魚亞科（Ommastrephinae）、褶柔魚亞科（Todarodinae）、滑柔魚亞科（Illicinae），共計11屬23種，大多為大洋性種類，十分強壯，游泳迅速［1］。柔魚亞科主要分類特征為漏斗淺穴內(nèi)生縱褶，兩側(cè)具邊囊，具皮下、內(nèi)臟和眼球發(fā)光器，一般認為柔魚亞科是柔魚科進化較晚的一個類群，包括6屬9種（圖 1，圖 2，表 1）［1－2］。隨著我國遠洋漁業(yè)不斷發(fā)展，柔魚等重要經(jīng)濟種類的生物學特征、資源動態(tài)、漁場環(huán)境等已經(jīng)積累了較多的研究資料［3－6］。對柔魚亞科系統(tǒng)進化關(guān)系的研究主要以形態(tài)學為主［2，7－10］。

目前DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成功地應用于頭足類研究的許多領(lǐng)域，包括種群結(jié)構(gòu)分析、物種鑒定、新種的發(fā)現(xiàn)、系統(tǒng)進化和生物多樣性研究。SALES等［11］利用16S和COI基因條碼，結(jié)合一個核基因標記（Rhodopsin基因），發(fā)現(xiàn)槍烏賊科的普氏槍烏賊（Doryteuthis plei）、皮氏槍烏賊（Doryteuthis pealei）、杜 氏 槍 烏 賊 （Uroteuthis duvauceli）和萊氏擬烏賊（Sepioteuthis lessoniana）均可能存在隱蔽種。MERIAM等［12］利用COI序列研究了烏賊（S．officinalis）的群體遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)。WAKABAYASHI等［13］利用16S和COI基因條碼片段探討了柔魚科的系統(tǒng)進化關(guān)系。YOSHIDA等［14］利用線粒體12S、16S和 COI基因片段研究了烏賊科的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

近年來，貝葉斯聯(lián)合模型分析多基因片段的方法廣泛應用于系統(tǒng)發(fā)育研究中［15－16］，聯(lián)合多基因片段分析能有效地增加系統(tǒng)發(fā)生分析的信號強度和置信度，并為不同進化速率的片段選擇最適進化模型和分組方法。運用貝葉斯法（BI）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，通過“聯(lián)合”途徑獲得的結(jié)果更可能接近正確的物種樹［17－18］。本研究擬利用線粒體COI和16S rRNA基因條形碼技術(shù)，選取柔魚亞科7個種（圖2）［19］，以太平洋褶柔魚和滑柔魚為外群，構(gòu)建貝葉斯聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)分類特征，探討柔魚亞科各種的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其研究結(jié)果可為柔魚等資源的保護和利用提供分子水平資料。

1 材料與方法

圖1 柔魚亞科各屬系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系樹（仿 ROELEVELD［2］）Fig．1 Phylogenetic tree of the Ommastrephinae（Figure based on ROELEVELD［2］）

1．1 實驗材料

本實驗所用柔魚亞科樣品共8尾，3尾柔魚樣品于2013年9月中旬遠洋捕撈船采自北太平洋區(qū)域（42°56′N、158°45′E），2尾莖柔魚樣品于2013年9月中旬遠洋捕撈船采自秘魯外海，1尾鳶烏賊樣品于2013年3月上旬采自我國南海，2尾發(fā)光柔魚（Eucleoteuthis luminosa）樣品于2015年8月底遠洋捕撈船采自千島群島附近（45°N、155°E）。以柔魚科另外兩個亞科的代表種—1尾太平洋褶柔魚（Todarodes pacificus）（褶柔魚亞科，2015年12月底采自日本海）、1尾阿根廷滑柔魚（Illex argentinus）（滑柔魚亞科，2015年7月底采自阿根廷近海）作為外群（表1）。所有樣品運回實驗室后取肌肉組織用95%乙醇固定，在－20℃條件下保存?zhèn)溆?。從GenBank上取得玻璃烏賊（Hyaloteuthis pelagica）、鳥柔魚、大西洋鳥柔魚（Ornithoteuthis antillarum）的序列參與分析。

圖2 本研究涉及的柔魚亞科7個種Fig．2 7 species of Ommastrephinae in this study

表1 本研究所用樣品信息Tab．1 Information of species used in this study

1．2 基因組DNA提取、片段序列測定

取柔魚肌肉100 mg左右，用海洋動物組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴增 COI基因的引物為 LCO1490：5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’和HCO2198：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’［20］；用于擴增 16S rRNA基因的引物為16Sar：5’-CGCCTG TTTAAC AAA AAC AT-3’和 16Sbr：5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’［21］。PCR反應體系總體積為 25μL，其中：10×buffer 2．5μL，MgCl21．5 mmol·L－1dNTP 200μmol·L－1引物各 0．2μmol·L－1，Taq酶1．25 U，模板 DNA 1μL，加滅菌蒸餾水至25μL。PCR反應在Eppendorf Mastercycler 5333擴增儀上進行。反應條件為：94℃預變性3 min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45 s，52℃退火45 s，72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。

以上反應均用陰性對照來檢查是否有DNA污染。取1．5μL擴增產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測。擴增產(chǎn)物送上海杰李生物科技有限公司測序。

1．3 數(shù)據(jù)分析

應用 Dnastar軟件包 （DNASATR，Inc．，Madison，USA）對所有序列進行編輯和排序校對。再應用Clustal X1．83對得到的序列進行序列比對。各種序列的多態(tài)性使用Arlequin（Ver．3．11；Excoffier等［22］）軟件進行分析。在 AIC（Akaike Information Criterion）標準下，使用MrModeltest 2．0選擇 DNA序列最佳替換模型［23］，運用 MrBayes v 3．1．2中的貝葉斯演繹法（Bayesian Inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［24］。采用 MCMC（Markov Chain Monte Carlo）算法，以隨機樹為起始樹，運行100000代，每100代取樣1次，開始的250個樣本作為老化樣本（burn-in samples）舍棄。采用分劃同質(zhì)性檢驗（partition homogeneity test）評價線粒體COI和16S rRNA基因片段聯(lián)合分析的可靠性［25］。運用MrModeltest 2．0軟件分別對以上2個基因片段及COI編碼片段的第1、2、3密碼子進行分析，獲得最適合本研究序列矩陣的核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù)，選擇合適的分組方法，聯(lián)合2個基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2．1 各基因片段獨立分析

獲得了柔魚亞科6個種的部分COI和16S rRNA基因片段，下載GenBank數(shù)據(jù)庫中的玻璃烏賊、鳥柔魚、大西洋鳥柔魚的相關(guān)序列，分析了9個種的COI和16S rRNA 2個基因片段的部分序列。COI基因共得到612 bp的序列，檢測到206個多態(tài)位點，占總序列的33．7%，簡約信息位點173個，沒有出現(xiàn)堿基的插入缺失，轉(zhuǎn)換顛換比（TS／TV）為2．3；在16S rRNA基因459 bp的基因位點上，發(fā)現(xiàn)71個多態(tài)位點，占總序列的15．5%，簡約信息位點50個，插入缺失8個位點，轉(zhuǎn)換顛換比為2．1。2個片段的轉(zhuǎn)換顛換比都大于 2，說明都尚未飽和［26］。

以阿根廷滑柔魚、太平洋褶柔魚為外群，運用最適模型構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹?；贑OI基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓撲結(jié)構(gòu)，運用了最適應模型HKY＋I＋G。結(jié)果顯示發(fā)光柔魚先依次與鳶烏賊、玻璃烏賊、莖柔魚聚為一大支，然后再與柔魚聚合，而鳥柔魚屬兩個種（鳥柔魚和大西洋鳥柔魚）形成一個單系群（monophyly）且與以上各種分化較大，外群的兩個種顯示了與以上各種較大的遺傳分化，同時該系統(tǒng)樹種間各分支都具有較高的后驗概率（0．75～1）（圖3）；基于16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹拓撲結(jié)構(gòu)，運用了最適應模型GIR＋I。結(jié)果顯示了較大的差異，首先柔魚與鳶烏賊聚為一支，然后依次與玻璃烏賊、莖柔魚，聚為一大支再與發(fā)光柔魚聚合，且鳥柔魚屬兩個種形成一個單系群，表現(xiàn)出與太平洋褶柔魚關(guān)系較近，該系統(tǒng)樹各分支的后驗概率方面除發(fā)光柔魚外，其余種間后驗概率過低（0．21～0．39）拓撲關(guān)系可信度較低（圖 4）。

2．2 片段聯(lián)合分析

線粒體COI和16S rRNA基因片段同質(zhì)性檢驗的結(jié)果顯示P值為0．52，說明這2個基因片段可以進行序列聯(lián)合分析。COI基因為編碼基因片段，其第1、2密碼子高度保守，而第3密碼子容易發(fā)生堿基替換，因此大部分系統(tǒng)發(fā)生信息存在于第3密碼子。將編碼片段COI的第1、2和3密碼子分別運用MrModeltest2．0軟件分析，獲得最適合本研究序列矩陣的核苷酸替代模型及相關(guān)參數(shù)（表2）。因此COI第1、2密碼子序列為一組；第3密碼子序列為一組；16S rRNA序列單獨為一組。根據(jù)分組方法和不同分區(qū)的最適進化模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。序列聯(lián)合分析系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，其系統(tǒng)結(jié)構(gòu)為發(fā)光柔魚依次與鳶烏賊、玻璃烏賊、莖柔魚聚為一大支，然后與柔魚聚合，鳥柔魚屬兩個種（鳥柔魚和大西洋鳥柔魚）兩個種形成一個單系群且與以上各種分化較大，外群的兩個種顯示了與本研究各種較大的遺傳分化。聯(lián)合分析得到的系統(tǒng)樹上各分支后驗概率很高，都接近于1（圖5）。

圖3 基于COI基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．3 Bayes phylogenetic tree of Ommastrephinae based on partial COI gene

圖4 基于16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．4 Bayes phylogenetic tree of Ommastrephinae based on partial 16S rRNA gene

3 討論

位于線粒體基因的16S rRNA和COI基因條碼是海洋生物分子系統(tǒng)研究中常用的分子標記，本研究基于這兩個基因片段分別構(gòu)建了柔魚亞科系統(tǒng)發(fā)生樹。研究結(jié)果的差異主要集中在兩方面：1）在鳥柔魚屬分類地位問題上，基于16S rRNA基因片段的系統(tǒng)樹顯示鳥柔魚屬兩個種，脫離了柔魚亞科范圍，表現(xiàn)出與太平洋褶柔魚關(guān)系較近，這種結(jié)果與 WAKABAYSHI等［13］研究結(jié)果相同，但基于COI基因片段的系統(tǒng)樹卻顯示鳥柔魚屬兩個種仍然與柔魚亞科其它種聚為一大支，這兩種結(jié)果都具有很高的后驗概率。2）在除鳥柔魚屬外，柔魚亞科內(nèi)部系統(tǒng)關(guān)系問題上，基于COI基因片段的系統(tǒng)樹各分支具有較高的后驗概率（0．72～1），具有較高的可信度，拓撲結(jié)構(gòu)顯示柔魚和莖柔魚親緣關(guān)系較近，且為分化較早的種類，而發(fā)光柔魚、鳶烏賊和玻璃烏賊親緣關(guān)系較近，為柔魚亞科分化較晚的種類，而基于16S rRNA基因片段的系統(tǒng)樹各分支的后驗概率方面除發(fā)光柔魚（值為1）外，其余種間后驗概率過低（0．21～0．39），拓撲關(guān)系可信度較低。線粒體16S rRNA基因因其較為保守而被較多地用于種以上階元的系統(tǒng)發(fā)育研究［27－29］，而本研究結(jié)果顯示其在柔魚亞科屬間的分析可能存在一定的局限。WAKABAYSHI等［13］基于16S rRNA基因片段運用3種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹柔魚亞科內(nèi)部同樣支持率過低，證實了以上觀點。

表2 不同分區(qū)及其最適進化模型和所包含位點數(shù)Tab．2 Data partitions，estimated models of sequence evolution and total number of characters of each partition

由COI片段獨立分析得到的結(jié)果與聯(lián)合兩個基因條碼構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)果一致，可信度均接近100%。因此我們以此分析結(jié)果討論。鳥柔魚屬在以往大部分研究中因其出現(xiàn)內(nèi)臟發(fā)光器和漏斗淺穴邊囊等特征，被歸入柔魚亞科［2，29－31］，本研究結(jié)果支持以上觀點，將鳥柔魚屬仍然歸入柔魚亞科，但屬于柔魚亞科中最原始種類。JEREB等［7］研究認為柔魚科種類在進化過程中經(jīng)歷了陸架坡、淺洋性、完全大洋性三個階段。鳥柔魚屬種類屬淺洋性種類，本研究結(jié)果顯示鳥柔魚屬可能是褶柔魚亞科向柔魚亞科進化過程中的過渡物種。

圖5 基于COI和16S rRNA基因片段序列構(gòu)建的柔魚亞科貝葉斯系統(tǒng)樹Fig．5 Bayes phylogenefic tree of Ommastrephinae based on partial COI and 16S rRNA gene

在以往的形態(tài)學研究中，如ROELEVELD［2］、ZUEV等［8］認為玻璃烏賊屬、發(fā)光烏賊屬親緣關(guān)系較近，最顯著的形態(tài)特征是外套膜上都具有特化的大型發(fā)光器（玻璃烏賊屬具圓斑點，發(fā)光烏賊屬具條狀）（圖2），而鳶烏賊與莖柔魚屬親緣關(guān)系近。但是，基于分子數(shù)據(jù)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊親緣關(guān)系較近。通過仔細研究鳶烏賊屬形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)其外套膜后背前部一大塊皮下發(fā)光器的集聚，形成一個大型發(fā)光器（圖2）。整個柔魚科種類中只有玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊3屬均有外套膜大型發(fā)光器［7］，可見本研究結(jié)果有一定的形態(tài)學依據(jù)。

本研究中柔魚與其它柔魚亞科種類存在較大的遺傳距離（枝長較長），可能提示有其獨特的進化路徑。從發(fā)光器這一特征來看，柔魚屬種類只有外套膜皮下發(fā)光器，這與柔魚亞科其它種類具有較大差別（其它種類包括最原始的鳥柔魚都具有內(nèi)臟和眼球發(fā)光器），ROELEVELD［2］研究認為這是柔魚亞科某祖先種在進化過程中丟失了內(nèi)臟和眼球發(fā)光器，產(chǎn)生了外套膜皮下發(fā)光器，進而形成了柔魚屬種類。本研究顯示柔魚與其它柔魚亞科種類存在較大的遺傳距離，可能預示著柔魚亞科種類一個新的進化方向。

綜上所述，玻璃烏賊、發(fā)光烏賊和鳶烏賊親緣關(guān)系較近，是柔魚亞科中分化較晚的種類，其次為莖柔魚、柔魚，鳥柔魚屬兩個種為柔魚亞科中最原始種類，且為褶柔魚亞科向柔魚亞科進化過程中的過渡物種。本研究同時顯示了各類發(fā)光器在柔魚亞科系統(tǒng)發(fā)育研究中具有非常重要的進化意義。但由于本研究樣品種類尚不完善，研究所用線粒體DNA是母系遺傳，僅能反映母本的遺傳特征，并且其各基因片段進化速率差異較大。今后有必要增加核基因標記的研究，并結(jié)合更多形態(tài)學特征，進一步完善柔魚亞科分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。