補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨折修復(fù)的影響*

黃奎 伍國(guó)鋒 鄒季*

骨質(zhì)疏松不僅導(dǎo)致骨脆性增加骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上升，同時(shí)亦影響骨折的愈合過程和結(jié)果，表現(xiàn)為骨痂形成量減少、骨折愈合質(zhì)量不佳和生物力學(xué)性能下降[1]。在中醫(yī)藥的使用過程中，發(fā)現(xiàn)了一些能促進(jìn)性腺功能和骨折愈合的藥物。補(bǔ)骨脂素是常用補(bǔ)腎中藥補(bǔ)骨脂中提取的一種有效活性成分，屬于呋喃香豆素類化合物的植物雌激素。我們前期研究結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂素灌胃治療可改善骨質(zhì)疏松小鼠骨微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能[2]。本實(shí)驗(yàn)擬通過鉬靶 X線、組織學(xué)和生物力學(xué)等檢測(cè)方法，觀察補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨折修復(fù)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 骨質(zhì)疏松小鼠造模

30只12周齡雌性C57BL/6小鼠，購買于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，平均體重（20.8±1.6）g。使用隨機(jī)數(shù)字表法，把30只C57BL/6J小鼠分為兩組，其中去卵巢組25只，假手術(shù)組5只。去卵巢組，行經(jīng)腹雙側(cè)卵巢切除，而假手術(shù)組在暴露卵巢后僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和骨質(zhì)疏松骨折模型建立

骨質(zhì)疏松小鼠造模6周后，去卵巢組和假手術(shù)組各取5只，小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色確認(rèn)骨質(zhì)疏松造模結(jié)果。在確定去卵巢骨質(zhì)疏松造模成功后，20只去卵巢組隨機(jī)分為2組：模型組和補(bǔ)骨脂素組，每組10只。所有小鼠在右側(cè)股骨中段建立橫形骨折，并用0.55mm直徑靜脈注射器針頭作為髓內(nèi)釘固定。

1.3 給藥方法

骨折術(shù)后第1天，通過藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算公式和根據(jù)我們以往的研究結(jié)果[2,3]，補(bǔ)骨脂素組按20mg/kg/d體重量灌胃，每天一次，連續(xù)21天，模型組以等劑量生理鹽水灌胃。

1.4 檢測(cè)方法

文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示正常小鼠股骨骨折愈合過程為3天時(shí)血腫形成，7天開始新骨形成，10天為軟骨痂形成高峰期，10～14天軟骨痂開始向硬骨痂轉(zhuǎn)換，21天骨折基本愈合[4-6]。

1.4.1 鉬靶X線

術(shù)后21天，每組隨機(jī)選取5只小鼠，小鼠拍攝右側(cè)股骨側(cè)位片（曝光條件：39kV，400mA，32ms），將中心聚焦在右側(cè)股骨骨折水平，在 DirectView（caresteream銳珂醫(yī)療）工作站采取原始圖像數(shù)據(jù)，在圖像4倍放大率下，作骨痂生成面積測(cè)定[7](AdobePhotoshopCS4圖像分析應(yīng)用軟件美國(guó))。

1.4.2 骨痂組織學(xué)

股骨標(biāo)本在鉬靶 X線檢測(cè)后，甲醛固定，放入 10%EDTA溶液中，在37℃的溫箱脫鈣2周。常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosinstaining,HE）染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察骨折愈合情況。

1.4.3 生物力學(xué)

隨機(jī)取5只小鼠在術(shù)后21天處死，取右側(cè)股骨行3點(diǎn)彎曲測(cè)試。測(cè)試時(shí)將所有股骨常溫解凍，在取出后12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。加載點(diǎn)位于股骨中段中點(diǎn)前側(cè)骨皮質(zhì)骨折線處，兩支點(diǎn)中間間距為10mm，設(shè)定加載速度為5 mm/min，其股骨后側(cè)骨皮質(zhì)為張力側(cè)。使用精密游標(biāo)卡尺，測(cè)量小鼠股骨橫截面內(nèi)外徑的最大和最小值，根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)方法[8]計(jì)算出最大載荷和最大應(yīng)力并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.5 試劑和主要儀器

補(bǔ)骨脂素（江蘇永健醫(yī)藥公司），鉬靶X光機(jī)（西門子，德國(guó)），生物力學(xué)測(cè)試機(jī)（Instron-8841，美國(guó)），TAIVA TB-718EL生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（泰維醫(yī)療科技有限公司，中國(guó)）TK-218V恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)（鴻邁醫(yī)療器械有限公司中國(guó)），TC-120C生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（斯歐醫(yī)療儀器公司，中國(guó)），LeicaRM2135石蠟切片機(jī)（LEICA，德國(guó)），Olympus BX-51顯微鏡（Olympus，日本）。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS公司，美國(guó)）進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松小鼠模型的確認(rèn)

骨質(zhì)疏松小鼠造模6周后，假手術(shù)組小鼠干骺端骨小梁致密較寬且粗細(xì)均勻，排列整齊，髓腔大小正常。去卵巢組小鼠，骨小梁變細(xì)，密度稀疏、間距變寬，髓腔寬大。對(duì)比兩組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)形態(tài)證明骨質(zhì)疏松小鼠造模成功（見圖1，2，彩圖見插頁）。

圖1，造模術(shù)后6周假手術(shù)組股骨遠(yuǎn)端HE染色，40X。

圖2，造模術(shù)后6周去卵巢組股骨遠(yuǎn)端HE染色，40X。

2.2 鉬靶X線結(jié)果分析

骨折術(shù)后第21天，模型組骨折線清晰，骨痂未填滿骨折斷端，骨折未愈合；補(bǔ)骨脂素組較模型組骨痂密度變高、骨折線模糊，基本愈合（見圖3，4）。使用圖像分析應(yīng)用軟件，比較2組小鼠骨痂形成面積顯示：兩組骨痂生成面積比較無明顯差異（見表1）。

圖3，術(shù)后21天模型組股骨骨折X線。

圖4，術(shù)后21天補(bǔ)骨脂素組股骨骨折X線。

表1 ，術(shù)后21天骨痂形成面積比較＞0.05。

表1 ，術(shù)后21天骨痂形成面積比較＞0.05。

?

2.3 骨痂HE染色分析

模型組術(shù)后21天，仍有可見大量軟骨細(xì)胞，部分鈣化，有少量編制骨。補(bǔ)骨脂素組術(shù)后21天軟骨細(xì)胞較模型組明顯減少，成骨細(xì)胞增生較活躍，軟骨骨化形成編織骨（見圖5，6，彩圖見插頁）。對(duì) 2組切片中的破骨細(xì)胞進(jìn)行觀察，補(bǔ)骨脂素組破骨細(xì)胞密度更稀疏，但兩組在骨痂表面都有破骨細(xì)胞的存在，破骨細(xì)胞緊密的附著在骨質(zhì)表面似乎正在吸收骨質(zhì)，破骨細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核數(shù)量未見明顯差異（見圖7，8，彩圖見插頁）。

圖5，術(shù)后21天模型組骨痂HE染色，40X（左），200X（右）。

圖6，術(shù)后21天補(bǔ)骨脂素組骨痂HE染色，40X（左），200X（右）。

圖7，術(shù)后21天模型組破骨細(xì)胞HE染色，200X。

圖8，術(shù)后21天補(bǔ)骨脂素組破骨細(xì)胞HE染色，200X。

2.4 生物力學(xué)分析

表2 ，術(shù)后21天最大載荷比較，*＜0.05。

表2 ，術(shù)后21天最大載荷比較，*＜0.05。

?

表3 ，術(shù)后21天最大應(yīng)力＞0.05。

表3 ，術(shù)后21天最大應(yīng)力＞0.05。

?

3 討論

治療骨質(zhì)疏松骨折時(shí)首要的目標(biāo)是預(yù)防骨折延遲愈合，除在改善手術(shù)方式和手術(shù)中應(yīng)用更新的手術(shù)器械、增加螺釘把持力以外，還需要采用綜合措施改善體內(nèi)骨折愈合環(huán)境，促進(jìn)骨折愈合并且預(yù)防再次骨折的發(fā)生。盡管，目前使用的幾種經(jīng)典的抗骨質(zhì)疏松藥物可以減少骨量丟失和骨折危險(xiǎn)性的發(fā)生，但它們對(duì)骨質(zhì)疏松骨折愈合的影響尚不完全明確并存在爭(zhēng)議?，F(xiàn)有學(xué)者開始關(guān)注因長(zhǎng)期使用雙膦酸鹽過度降低骨轉(zhuǎn)化水平而對(duì)骨折愈合導(dǎo)致的不良影響[9,10]。

腎虛在中醫(yī)里被認(rèn)為是所有骨與關(guān)節(jié)疾病的根源，腎虛導(dǎo)致機(jī)體退變的重要因素，可引起發(fā)育障礙、骨骼脆弱等表現(xiàn)例如骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)炎等。長(zhǎng)久以來在我國(guó)和東南亞國(guó)家，補(bǔ)腎中藥已被用于治療各種骨傷科疾病，并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)[11]。現(xiàn)在新藥開發(fā)者已將目光投向通過現(xiàn)代生物學(xué)、化學(xué)和藥學(xué)的方法從傳統(tǒng)天然中草藥中甄別和獲得能治療骨質(zhì)疏松和骨折的有效成分[12]。補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂中提取的一種有效活性成分，屬于呋喃香豆素類化合物的植物雌激素。因雌激素受體在骨組織的廣泛分布，導(dǎo)致植物雌激素可做為一種治療骨質(zhì)疏松癥潛在的天然活性藥物。研究表明植物雌激素能抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，減少抗酒石酸酸性磷酸酶的表達(dá)和吡啶啉的分泌，并增加骨形成，提高骨密度，堿性磷酸酶、骨鈣素、骨橋蛋白和I型膠原水平，從而降低骨轉(zhuǎn)換水平和提高骨生成率[13]。

補(bǔ)骨脂素能通過MAPK-NF-kB信號(hào)和BMPs信號(hào)通路激活成骨細(xì)胞，增加成骨[14,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與模型組比較，補(bǔ)骨脂素組表現(xiàn)出對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨折修復(fù)有改善作用。與模型組比較，補(bǔ)骨脂素組骨痂X線密度更高，HE組織學(xué)中成骨細(xì)胞活躍，較多編織骨形成。比較兩組小鼠骨痂形成面積無明顯差異，結(jié)合生物力學(xué)分析，最大載荷是骨結(jié)構(gòu)力學(xué)指標(biāo)，表現(xiàn)的是骨結(jié)構(gòu)力學(xué)特性[16]，不僅與骨組織本身的材料特性有關(guān)，也受骨的尺寸和幾何形狀的影響。最大應(yīng)力是骨組織材料力學(xué)性能指標(biāo)，受骨組織內(nèi)骨礦鹽含量和膠原纖維走向等骨基質(zhì)成分變化的影響。提示補(bǔ)骨脂素增加骨痂內(nèi)礦化程度，骨折愈合質(zhì)量增加。

我們前期研究中[2]，補(bǔ)骨脂素作為一種植物雌激素，與雌二醇作用類似，能明顯降低去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的血清I型膠原羧基末端肽水平，提示補(bǔ)骨脂素對(duì)破骨細(xì)胞有一定的抑制作用。破骨細(xì)胞對(duì)骨痂重塑至關(guān)重要[17,18]，在本次對(duì)骨痂組織HE染色的病理檢測(cè)中，同時(shí)觀察到2組骨痂表面均有破骨細(xì)胞存在，而破骨細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核分葉的數(shù)量并未見明顯差異、破骨細(xì)胞成熟度相當(dāng)，提示補(bǔ)骨脂素沒有對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行過度抑制，亦未影響骨痂塑形過程。

綜上所述，補(bǔ)骨脂素作為一種植物雌激素能有效改善骨質(zhì)疏松小鼠骨痂愈合質(zhì)量和生物力學(xué)性能。但本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足，首先，我們僅使用了單一劑量的補(bǔ)骨脂素，其量效關(guān)系和補(bǔ)骨脂素改善骨質(zhì)疏松骨折愈合的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。另外，骨折早期愈合并不包含完整的骨折塑形過程，補(bǔ)骨脂素作為植物雌激素所表現(xiàn)出的抑制破骨細(xì)胞的作用對(duì)骨痂整個(gè)塑形過程的影響也需進(jìn)一步的觀察。