不同施肥模式對鹽堿化稻作土壤細(xì)菌群落的影響

李 明，張俊華

(寧夏大學(xué) 環(huán)境工程研究院，寧夏 銀川 750021)

土壤鹽漬化及鹽堿障礙是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制性因子，在人口不斷增長，耕地逐漸減少的情況下，改良利用鹽堿地對增加耕地后備資源、改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。中國是一個鹽漬化土壤分布廣泛的國家，鹽漬化土壤面積達(dá)3.6×107hm2，寧夏銀北地區(qū)鹽漬化土壤面積約11.4×104hm2，是非鹽堿耕地面積的2.15倍，且多為低產(chǎn)田或撂荒地。黃河水灌溉淋鹽與排水相結(jié)合的方法，是當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)的鹽堿地改良方式[1]。受水資源短缺，降水稀少，蒸發(fā)量大的影響，傳統(tǒng)的灌溉淋鹽方式不適合在當(dāng)?shù)亻L期實施。因此，在黃河用水日趨減少的形勢下，開展鹽堿地改良有效培肥措施的研究，對提高鹽堿地肥力，將鹽堿地變廢為寶具有很大的意義[2]。

脫硫廢棄物改良鹽堿地的技術(shù)原理是：脫硫廢棄物中的Ca2+和Mg2+置換了土壤中的代換性鈉，使土壤鹽分降低，以及土壤耕作破壞了土壤結(jié)構(gòu)，使土壤中下層鹽分不能上升，改善了土壤的化學(xué)狀況，從而為作物的正常生長提供了較好的土壤環(huán)境[3]。另外，也有研究認(rèn)為有機(jī)肥料在改良鹽堿化土壤方面有應(yīng)用前景。有機(jī)肥能夠促進(jìn)表層土壤脫鹽，可溶性陽離子Na+、K+的下移量大于Ca2+和Mg2+，顯著增加土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，以及增加土壤微生物數(shù)量[4, 5]。然而，關(guān)于脫硫廢棄物和有機(jī)肥的不同配比模式對鹽堿地土壤改良效果的系統(tǒng)研究尚未見相關(guān)的報道。

土壤微生物群落的變化可以作為土壤肥力狀況的重要生物學(xué)指標(biāo)，其變化有賴于土壤的肥力水平和環(huán)境狀況[6]。在鹽堿地改良過程中，微生物和改良行為之間產(chǎn)生什么交互影響，尚未見報道。對鹽堿地土壤生理生態(tài)指標(biāo)的研究是基礎(chǔ)性的工作，有必要以此建立可以作為綜合評價土壤改良行為效果的指標(biāo)。

本研究擬選取脫硫廢棄物和有機(jī)肥不同配比施肥模式，分析不同施肥模式對鹽堿化土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)的影響，探討稻作條件下不同施肥模式對鹽堿地的改良培肥效果，突破鹽堿地堿性成分不易改良和肥力提升緩慢的技術(shù)難點，篩選出適宜鹽堿地土壤改良培肥的最佳施肥模式。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗設(shè)在寧夏石嘴山市平羅縣西大灘前進(jìn)農(nóng)場試驗基地，位于寧夏賀蘭山東麓洪積扇邊緣，屬于黃河中上游灌溉地區(qū)(106°13′～106°26′E，38°45′～38°55′N)，該地區(qū)屬干旱的大陸性氣候。年降水量約為105～205 mm，年蒸發(fā)量1 875 mm，全年無霜期為220 d。試驗地土壤類型為白僵土(龜裂堿土)，高度堿性，弱度鹽化，鈣的有效性低。一般地下水埋深1.5 m左右，地下水主要含硫酸鹽、氯化物，并且普遍含有蘇打。試驗地為2015年新開墾土地，于開墾當(dāng)年施用脫硫廢棄物。供試水稻品種為“吉特605”。有機(jī)肥為腐熟羊糞。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置5個處理，1)對照Control(不施脫硫廢棄物和有機(jī)肥)；2)T1處理(脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2)；3)T2處理(31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥10 000 kg·hm-2)；4)T3(31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥18 000 kg·hm-2)；5)T4(脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥25 000 kg·hm-2)，每個處理3次重復(fù)，小區(qū)面積48 m2(6 m×8 m)。

試驗于2016年5月4日施肥翻地，5月7日灌水(引黃河水灌溉，生育期總灌水10次)，5月19日播種，旱直播，每公頃播量375 kg，10月12日收獲。

1.3 樣品采集

于水稻成熟期9月20日采集根層土壤(5～20 cm)，采用多點采樣的方法，每個試驗小區(qū)分5點采集土樣充分混勻，將新鮮土樣分成2份，一份低溫冷藏帶回實驗室，在-20℃冷凍保存，用于土壤微生物的測定，另一份帶回實驗室室內(nèi)風(fēng)干用于測定pH值、電導(dǎo)率值(EC)、有機(jī)碳和速效養(yǎng)分。

1.4 樣品分析

1.4.2 土壤DNA的提取 土壤樣品中總DNA的提取采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(Carlsbad，USA)試劑盒提取總DNA，提取過程按試劑盒說明書進(jìn)行，得到DNA提取物后，-20℃凍存。提取的DNA用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段大小。

1.4.3 IlluminaHiSeq測序及數(shù)據(jù)分析 本研究目標(biāo)基因為細(xì)菌的16S rRNA V4區(qū)基因片段，所用的引物為515F/806R[7]。反應(yīng)體系：15μl Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, UK)，F(xiàn)orward Primers (0.2μM)，Reverse Primers (0.2μM)，10ngDNA模板。擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[8]。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測，將目標(biāo)條帶切膠回收純化進(jìn)行下一步的分析。

用于PCR擴(kuò)增的引物外側(cè)都會加入一段barcode序列進(jìn)行區(qū)分，序列為一段6bp堿基的寡核苷酸序列，每個樣品用不同barcode序列進(jìn)行區(qū)分。Barcode序列由上海吉美生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計并合成。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后(Qiagen膠回收試劑盒)，用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc. USA)測定濃度，等摩爾混合后采用完成文庫構(gòu)建，安排上機(jī)測序。高通量測序由諾禾致遠(yuǎn)Illumina MiSeq 2500平臺運(yùn)行(Beijing, China, http://www.novogene.com/index.php)，最后所測得數(shù)據(jù)在250～300 bp之間產(chǎn)生。

所測得原始序列截去Barcode序列和引物序列后，經(jīng)FLASH(V1.2.7，參數(shù)設(shè)置為-m 10 -f 300 -x 0.1- p 33 -r 219-r 180 - M 135)拼接獲得原始數(shù)據(jù)Tags數(shù)據(jù)。原始Tags經(jīng)QIIME(V1.7.0，質(zhì)控參數(shù)為QIIME默認(rèn)值，參照http://qiime.org/scripts/split_libraries.html)過濾處理獲得高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)，并與數(shù)據(jù)庫(Gold database, http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對(UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)檢測嵌合體序列，最終獲得有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。測序深度為每個文庫原始reads數(shù)不少于5萬條。后以97%相似性為依據(jù)，利用UPARSE pipeline軟件(V7.0.1001)將各序列聚類成為OTUs。為獲得土壤樣品中細(xì)菌群落的多樣性信息，使用uclust軟件對所得序列進(jìn)行聚類，并利用RDP classifier(V2.2)[9]軟件與GreenGene數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)進(jìn)行物種注釋，統(tǒng)計每個樣品在各分類水平上的構(gòu)成。利用QIIME(V1.7.0)計算不同樣品中細(xì)菌群落的α多樣性和β多樣性指數(shù)[10]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SAS中Duncan法檢驗不同處理土壤屬性和微生物指標(biāo)間的差異顯著性， RDA分析采用Conoco(5.0)軟件，繪圖使用OriginPro 8軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥模式對水稻土壤屬性的影響

不同施肥模式對稻作條件下鹽堿土壤有機(jī)碳及速效養(yǎng)分的影響很大。施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和有機(jī)肥25 000 kg·hm-2(T4)與對照組土壤相比，提高了有機(jī)碳(6.74%)、堿解氮(37.20%)、速效磷(47.83%)和銨態(tài)氮(96.26%)。另外，雖然統(tǒng)計分析結(jié)果不顯著，但是pH值在不同施肥模式處理中都有所降低。

2.2 不同施肥模式對原土鹽堿地水稻產(chǎn)量的影響

施用脫硫廢棄物和有機(jī)肥可以顯著提高水稻的收獲穗數(shù)和千粒重(表2)，處理4的千粒重和產(chǎn)量達(dá)到最大值，與對照組相比較存在顯著差異(P<0.05)，其中千粒重較對照增加37%、產(chǎn)量增加18%。說明處理4有效提高了土壤有機(jī)質(zhì)及速效養(yǎng)分的含量，改善了土壤生物活性，促進(jìn)了水稻的生長發(fā)育。

2.3 不同施肥模式對水稻土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)段的測序結(jié)果表明，試驗小區(qū)內(nèi)土壤中細(xì)菌群落多樣性較低，其中α多樣性香農(nóng)指數(shù)均值9(±0.2)。施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥25 000 kg·hm-2(T4)的水稻土壤細(xì)菌群落香濃指數(shù)較對照顯著增加(P<0.01，表3)。統(tǒng)計分析表明，T3和T2施肥模式處理組的多樣性指數(shù)均高于對照組，但與對照間并無顯著差異。

表1 不同施肥模式水稻土壤屬性的變化

注：圖中數(shù)據(jù)均為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，C=Control，T1=脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2；T2=脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥10 000 kg·hm-2；T3=脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥18 000 kg·hm-2；T4=脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥25 000 kg·hm-2，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Data shown were the means ± SD (n=3), C=Control, T1=flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2, T2=flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2+organic fertilizer 10 000 kg·hm-2, T3=flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2+organic fertilizer 18 000 kg·hm-2, T4=flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2+organic fertilizer 25 000 kg·hm-2. Different letters mean significant difference at 0.05 level. The same below.

表2 不同施肥對水稻產(chǎn)量的影響

表3 不同施肥模式水稻土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

2.4 OUT豐度在門水平的變化分析

對不同施肥模式的樣品中優(yōu)勢細(xì)菌門的分析表明，水稻土壤中相對豐度排名前十的優(yōu)勢細(xì)菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋菌門(Spirochaetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)，這些細(xì)菌的豐度各占樣品所測序列總數(shù)的96.05%～94.32%(圖1)，均為土壤常見菌群。

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)， T4處理組變形菌門、螺旋菌門和硝化螺旋菌門都顯著高于其它處理組(P<0.05)，但芽單胞菌門和酸桿菌門則顯著低于其它處理組。

2.5 不同施肥模式水稻土壤細(xì)菌群落在屬水平的豐度變化分析

從屬水平對不同樣品中細(xì)菌的相對豐度變化分析表明，相對豐度排名前35的細(xì)菌屬的總比例分別占不同施肥模式水稻土壤測序reads數(shù)的41.98%～18.52%。這些屬在不同處理中的相對豐度及其進(jìn)化關(guān)系如圖2所示。這些細(xì)菌中，鹽單胞菌(Halomonas)、Sulfurimonas、Lutibacter、Sphingorhabdus、Alkaliflexus、Spirochaeta-2、Treponema-2、Rhodonellum、Thiohalomonas、Albidiferax、假單胞菌屬(Pseudomonas)、unidentified-Anaerolineaceae的相對豐度在施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和25 000 kg·hm-2有機(jī)肥處理組(T4)中較高，而Haliangium、Pontibacter、Marinicella、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、Anaerolinea、Thalassospira、Simplicispira、溶桿菌屬(Lysobacter)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、Gillisia在對照組和施用脫硫廢棄物31 250 kg·m-2(T1)處理組中相對豐度較高。

圖1 不同施肥模式水稻土壤細(xì)菌各門類相對豐度圖Fig.1 The relative abundance of bacterial phylum ofdifferent fertilization patterns in paddy soils

圖2 不同施肥模式水稻土壤優(yōu)勢細(xì)菌屬類相對豐度變化Fig.2 The relative percentages of the bacterial genus ofdifferent fertilization patterns in paddy soils

2.6 不同施肥模式對水稻土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

主成分分析發(fā)現(xiàn)，施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和有機(jī)肥25 000 kg·hm-2(T4)的處理對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，對照處理和施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2(T1)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為接近，施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和有機(jī)肥18 000 kg·hm-2(T3)和脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和有機(jī)肥10 000 kg·hm-2(T2)與對照中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都較為相似(圖3)。

注：主成分分析。 Note: Principal Coordinate Analysis (PCA).圖3 不同施肥模式稻作土壤細(xì)菌群落主成分分析Fig.3 The β-diversity of paddy soil bacterial communitiesin different fertilization patterns

2.7 RDA分析

為了解土壤理化性質(zhì)變化對不同施肥模式水稻土壤細(xì)菌群落組成的影響，利用Canoco 5.0進(jìn)行冗余分析(RDA)。結(jié)果表明，所測的十種土壤屬性因子中，堿解氮和銨態(tài)氮顯著影響水稻土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，分別解釋了16.9%和14.0%(P<0.05，圖4)。土壤pH值、電導(dǎo)率值和有機(jī)碳的影響均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

土壤微生物多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能息息相關(guān)[11]。從細(xì)菌的組成來看，Proteobacteria在細(xì)菌群落中占絕對的優(yōu)勢，其它門如Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Chloroflexi、Firmicutes、Acidobacteria、Gemmatimonadetes及Nitrospirae均為農(nóng)田土壤中的常見門類[12]。Proteobacteria 施用有機(jī)肥最多的T4處理組顯著增加，導(dǎo)致這種差異的深層機(jī)制可以歸結(jié)為：稻田土壤中變形菌門細(xì)菌包含多種代謝種類，其中又以異養(yǎng)或者混合營養(yǎng)型微生物占優(yōu)勢，這類細(xì)菌的生長需要有機(jī)化合物作為碳源，通過氧化有機(jī)化合物來獲取能量。T4處理組中有機(jī)肥含量最高，因此豐富的有機(jī)底物和養(yǎng)分為這些類群細(xì)菌提供了更多的碳源，因此變形菌門類群相對豐度增加[13]。Ge等[14]研究了長期施肥的農(nóng)耕土壤細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)變性細(xì)菌在細(xì)菌類群中占統(tǒng)治地位(30.5%)，第二大優(yōu)勢類群是酸桿菌(15.3%)。這與本研究結(jié)果略有所不同，在本研究中，Bacteroidetes是土壤中僅次于Proteobacteria的第二大微生物類群。研究證實，Bacteroidetes在降解長鏈脂肪酸時具有重要作用[15]。一些長鏈脂肪酸，如十二烷酸、油酸、辛酸和豆蔻酸等，尤其是十二烷酸是毒害作用最強(qiáng)的長鏈脂肪酸。Wang等[16]在CSTR厭氧消化牛糞、牛糞與少量秸稈混合產(chǎn)甲烷過程中以及處理一些富含糖類物質(zhì)的廢棄物中發(fā)現(xiàn)Bacteroidetes為優(yōu)勢菌群。Bacteroidetes在很多中溫發(fā)酵產(chǎn)甲烷系統(tǒng)中均為優(yōu)勢種群，表明這類細(xì)菌有利于厭氧條件下有機(jī)物的分解、酸化，促進(jìn)營養(yǎng)元素的循環(huán)[17]。

注：1,2,3代表不施用改良劑和肥料處理樣品3次重復(fù)；4,5,6代表施用脫硫廢棄物處理31 250 kg·hm-2；7,8,9代表脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥10 000 kg·hm-2；10,11,12代表31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥18 000 kg·hm-2；13,14,15代表31 250 kg·hm-2+有機(jī)肥25 000 kg·hm-2。Note: 1, 2 and 3 represent triplicate samples from plots that remained unfertilized; 4, 5, 6 from plots that received flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2; 7, 8, 9 from plots that received flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2 + organic fertilizer 10 000 kg·hm-2; 10, 11, 12 from plots received flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2 + organic fertilizer 18 000 kg·hm-2; 13, 14, 15 flue gas desulfurization gypsum by-products 31 250 kg·hm-2+organic fertilizer 25 000 kg·hm-2圖4 RDA分析土壤屬性對細(xì)菌群落分布的影響Fig.4 RDA analyses of the bacterial 16S rRNA compositionin five fertilization treatment of paddy soils

不同施肥處理導(dǎo)致稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異明顯。本研究供試的稻田土壤僅施改良劑和有機(jī)肥的量有所不同，造成土壤理化性質(zhì)差異很大，從而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。但是這種多樣性差異，可能是外界環(huán)境調(diào)節(jié)綜合因素共同作用的結(jié)果。張平究等[18]對太湖地區(qū)水稻土長期試驗的研究也指出，長期有機(jī)肥和化肥配施顯著提高了土壤細(xì)菌的多樣性。劉恩科[19]等指出化肥配施有機(jī)物料改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。本研究的結(jié)論與上述研究類似，測序結(jié)果表明，α多樣性受到了有機(jī)肥處理的影響，在施用有機(jī)肥最多的T4處理組，多樣性指數(shù)顯著增加。這表明，在一定程度上，施用有機(jī)肥料后，土壤有機(jī)質(zhì)和氮磷鉀等養(yǎng)分含量提高，土壤中變形菌大部分類群為異樣或者兼性營養(yǎng)菌，豐富的有機(jī)底物和養(yǎng)分為這部分微生物類群的生長提供了可溶性的營養(yǎng)物質(zhì)和能力[20,21]。

研究證實，土壤pH和EC是微生物組成和潛在微生物脅迫的有力預(yù)測者[22,23]。在施用脫硫廢棄物后土壤的鹽分(EC)含量除了T2處理組外，都有所增加。周曉燕[24]等研究認(rèn)為，施用脫硫廢棄物后，土壤中含鹽量也隨著增加，其原因是由于脫硫廢棄物本身也是一種鹽，施用一定量會使土壤中鹽濃度升高。鹽分的增加為嗜鹽菌提供了適宜的生長環(huán)境，因而鹽單胞菌(Halomonas)在對照、T1和T4處理組的相對豐度都較高，其中在T4處理組顯著增加。另外，在施用有機(jī)肥最多的T4處理組，土壤全氮、堿解氮、銨態(tài)氮都有所升高，其中堿解氮和銨態(tài)氮較對照組顯著的升高，推測這一結(jié)果可能刺激了螺旋菌門和硝化螺旋菌門的生長。RDA分析表明，土壤堿解氮和銨態(tài)氮是影響不同施肥模式鹽堿化水稻土壤細(xì)菌群落變化的主要因素，鹽堿化水稻土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到土壤環(huán)境因素的影響。一般在鹽堿化環(huán)境中都會出現(xiàn)C、N素缺乏，因此，N素的投入對此類環(huán)境顯得非常重要[25]。土壤養(yǎng)分也能很好的預(yù)測微生物生物標(biāo)記或豐度[23]。Wallis 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，土壤條件(包括有效磷、鎂離子、總陽離子、鉀和有機(jī)質(zhì))與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成顯著相關(guān)。

4 結(jié) 論

從以上分析可以發(fā)現(xiàn)，不同施肥模式導(dǎo)致土壤理化性狀和肥力水平發(fā)生顯著變化，并對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了深刻的影響。其中，施用脫硫廢棄物31 250 kg·hm-2和有機(jī)肥25 000 kg·hm-2(T4)處理組的多樣性顯著增加，而變形菌門、螺旋菌門和硝化螺旋菌門都顯著高于其它處理組。與此結(jié)果相一致的，T4處理組中水稻產(chǎn)量也是最高的。本研究結(jié)果表明施用脫硫廢棄物和有機(jī)肥對鹽堿地具有一定的改良效果，以T4處理組的改良效果最顯著。但以上論述僅是短期內(nèi)觀測，對于不同施肥模式在鹽堿地改良過程中的生態(tài)效益評價，仍需利用分子生物學(xué)手段分析長期不同施肥模式下鹽堿化稻作土壤微生物群落多樣性和其功能的變化規(guī)律，這對于篩選鹽堿土改良培肥的最佳施肥模式和深入理解稻田土壤碳循環(huán)過程都具有重要意義。